Эндометриоз — процесс, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобной эндометрию [1—3]. Эндометриоз поражает 10% женщин репродуктивного возраста и 35—50% женщин с тазовой болью и бесплодием [1, 4]. Поскольку только медикаментозное лечение эндометриоза имеет низкую эффективность, методом выбора является оперативное лечение. Однако рецидив заболевания по-прежнему остается очень важной проблемой: у 40—45% пациенток наблюдается рецидив в течение 5 лет после первичного оперативного лечения, что приводит к необходимости повторной операции [5].

Несмотря на большой интерес мирового сообщества к эндометриозу, практически не изучен вопрос о прогнозировании рецидивирования различных фенотипических форм эндометриоза [2, 3, 6]. Проведено множество эпидемиологических исследований по определению факторов риска рецидивирования, однако результаты этих исследований во многом противоречат друг другу [7—10].

Поэтому биомаркеры в тканях могут стать надежными предикторами рецидивирования эндометриоза и иметь большое практическое значение, так как позволят сразу после операции определять пациенток с высоким риском данного осложнения и отсрочить или предотвратить его. Определение и дальнейшее исследование этих биомаркеров также позволят изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе патогенеза рецидивирования эндометриоза, что в дальнейшем даст возможность модулировать данные механизмы для устранения фундаментальных причин рецидива. Однако в настоящее время результаты исследований биомаркеров рецидивирования также довольно противоречивы [5, 11].

Цель исследования — изучить экспрессию факторов пролиферации и апоптоза (Ki-67, Bcl-2), воспалительных факторов (NF-kβ p65, COX-2), факторов адгезии (β-катенин), эстрогеновых (ER-α) и прогестероновых (PR-α) рецепторов в эндометриоидных кистах яичников (ЭКЯ) у пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ иммуногистохимическим методом.

В исследование включены 48 пациенток с ЭКЯ (средний возраст составил 31,25±5,18 года), находившихся на лечении в отделении оперативной гинекологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в 2015—2017 гг.

В зависимости от течения заболевания биоматериал обследуемых пациенток разделен на две группы: 1-я группа — капсула ЭКЯ от 19 пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ (основная группа); 2-я — капсула ЭКЯ от 29 пациенток без рецидива (группа сравнения).

В работе использовали гистологический и иммуногистохимический методы исследования. После фиксации в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч и стандартного протокола гистологической проводки материал заливали в парафин. Далее серийные срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводили на световом микроскопе при увеличении от 50 до 400.

Иммуногистохимическое исследование капсулы ЭКЯ проводили при помощи набора Tissue-Tek Quick-Ray, который позволяет изготавливать парафиновые блоки с большим количеством образцов тканей (тканевые матрицы). Тканевая матрица (tissue microarray) — это парафиновый блок, в котором упорядоченно расположены фрагменты тканей, вырезанные из заранее определенных участков других парафиновых блоков. Парафиновые столбики с образцами ткани, извлеченные с помощью ручки-перфоратора, помещали в готовые парафиновые матрицы, затем заливали парафином и отправляли на микротомию. Полученный после микротомии срез помещали на предметное стекло и подвергали дальнейшей окраске. В исследовании использовали моноклональные кроличьи антитела к Ki-67 (clone 30−9, VENTANA), ER-α (clone SP1, VENTANA) и PR-α (clone 1E2, VENTANA), моноклональные мышиные антитела к Bcl-2 (clone 124, VENTANA), β-катенину (clone 14, VENTANA) и COX-2 (clone СХ-294, Agilent), поликлональные кроличьи антитела к NF-kβ p65 (clone p65, «Spring Bioscience Corp.»). Препараты готовили по стандартному протоколу с использованием иммуногистостейнера Ventana Ultra. Для правильной постановки иммуногистохимических реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергали стандартной процедуре иммуногистохимической реакции, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы-производителя.

Оценку результатов для Ki-67 осуществляли следующим образом: экспрессию Ki-67 подсчитывали в процентах на 3000 клеток одного типа.

Результаты для Bcl-2, СОХ-2 и β-катенина оценивали следующим образом: 0 баллов — отсутствие экспрессии, 1 балл — слабая экспрессия, 2 балла — умеренная экспрессия, 3 балла — сильная экспрессия.

Для NF-kβ p65 оценку результатов осуществляли по иммуногистохимической шкале Ota [12]. Интенсивность определяли в баллах: 1+, 2+ и 3+. Чувствительность оценивали в баллах: 1+ – 0—10% позитивно окрашенных клеток, 2+ – 10—50% позитивно окрашенных клеток, 3+ — более 50% позитивно окрашенных клеток.

Оценку результатов для ER-α и PR-α проводили с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета Histo-score по формуле: HS = 1а + 1b + 3c, где а — процент слабо окрашенных клеток, b — процент умеренно окрашенных клеток, с — процент слабо окрашенных клеток. Результаты оценивали по следующей шкале: 0—10 баллов — отсутствие экспрессии, 11—80 баллов — слабая экспрессия, 80—140 баллов — умеренная экспрессия, 141—300 баллов — выраженная экспрессия.

Статистический анализ полученных данных проводили с применением стандартных методов математико-статистической обработки с использованием пакетов программ прикладного статистического анализа (Statistica для Windows 10.0, SPSS Statistics 22, Microsoft Excel). Для оценки межгрупповых различий значений признаков применяли тест Манна—Уитни. Для всех критериев и тестов величину критического уровня значимости принимали равной 0,05, т. е. различия признавали статистически значимыми при p<0,05.

Исследована экспрессия факторов пролиферации и апоптоза (Ki-67, Bcl-2), воспалительных факторов (NF-kβ p65, COX-2), факторов адгезии (β-катенина), эстрогеновых (ER-α) и прогестероновых (PR-α) рецепторов у 47 пациенток с ЭКЯ в возрасте от 18 до 45 лет (см. таблицу,

Экспрессия ER-α в стромальном и эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ статистически значимо не различается между обследуемыми группами пациенток (см. таблицу, рисунок).

Среднее значение экспрессии PR-α в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 260,67 балла (медиана 270, интерквартильный размах 250—280), среднее значение экспрессии PR-α в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения — 271,15 балла (медиана 280, интерквартильный размах 270—280) (р=0,18, тест Манна—Уитни). Среднее значение экспрессии PR-α в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 188,46 балла (медиана 220, интерквартильный размах 220—250), среднее значение экспрессии PR-α в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения — 71,15 балла (медиана 10, интерквартильный размах 10—20). Экспрессия PR-α в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из основной группы достоверно выше по сравнению с пациентками из группы сравнения (р=0,0277, тест Манна—Уитни) (см. таблицу, рисунок).

По данным исследования, экспрессия PR-α достоверно повышена в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ у пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ, а экспрессия ER-α в стромальном и эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ статистически значимо не различается между группами пациенток. Полученные результаты согласуются с данными других исследований, согласно которым уровень экспрессии ER в эутопическом эндометрии и эктопических эндометриоидных очагах не зависит от наличия/отсутствия рецидива эндометриоза [13]. Известно, что в эктопической эндометриоидной ткани изменена экспрессия ER и PR [14—17]. Однако уровень mRNA ER-β, но не ER-α, повышен в эктопической эндометриоидной ткани по сравнению с эутопическим эндометрием [14], а эктопический эндометриоидный рост происходит только у подгруппы женщин с повышенным отношением ER-β/ER-α и сниженным PR-β/PR-α, что приводит к увеличению локальной продукции эстрогенов и способствует росту эндометриоидных очагов [14]. Также известно, что экспрессия ER-α в основном обнаруживается в эутопическом эндометрии пролиферативной фазы, а не в эктопической эндометриоидной ткани от женщин с эндометриозом яичников [18]. Супрессия ER-α, наблюдаемая в эутопическом эндометрии секреторной фазы, имеет важное значение для успешной имплантации и децидуализации эутопического эндометрия [14, 16]. Уровень экспрессии PR значительно снижен в эктопических эндометриоидных очагах при сравнении с эутопическом эндометрием от тех же женщин [13]. Известно, что эктопическая эндометриоидная ткань не реагирует на действие прогестерона, а фенотип эндометриоидной ткани с резистенцией к прогестерону связан с повышенной способностью к клеточной пролиферации и выживаемостью [14, 17].

Среднее значение экспрессии Ki-67 в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 14,31% (медиана 10%, интерквартильный размах 5—14,3%), среднее значение экспрессии Ki-67 в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения — 11,41% (медиана 10%, интерквартильный размах 10—15%) (р=0,487, тест Манна—Уитни). Среднее значение экспрессии Ki-67 в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 3,08% (медиана 0%, интерквартильный размах 5—12,5%), среднее значение экспрессии Ki-67 в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения — 9,07% (медиана 5%, интерквартильный размах 2—13,75%). Экспрессия Ki-67 в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из основной группы достоверно ниже по сравнению с пациентками из группы сравнения (р=0,044, тест Манна—Уитни) (см. таблицу, рисунок).

Антиген Ki-67 — это ядерный белок, который связан с процессами клеточной пролиферации, участвуя в транскрипции рибосомальной РНК. По данным исследования S. Yalcin и соавт. [19], не найдено статистически значимых различий между средними значениями индекса пролиферации Ki-67 у пациенток с ранними стадиями эндометриоза I—II степени с рецидивом ЭКЯ и без рецидива. Статистически значимые различия найдены только между средними значениями индекса пролиферации Ki-67 у пациенток с эндометриозом III—IV степени с рецидивом ЭКЯ и без рецидива [19].

По данным нашего исследования [20], экспрессия Bcl-2 в стромальном и эпителиальном компонентах капсулы ЭКЯ статистически значимо не различается между обследуемыми группами пациенток (см. таблицу, рисунок). Известно, что пропорция между Bcl-2- и Bax-протеинами играет важную роль в процессе апоптоза. Bcl-2 выполняет антиапоптотическую роль, ингибируя смещение цитохрома C от межмембранной митохондриальной области к цитозолю, а также ингибирует проапоптотические действия Bax- и Bak-белков. По данным других исследований [11], экспрессия Bcl-2 повышена в эутопическом эндометрии у пациенток с эндометриозом по сравнению с эктопическими эндометриоидными очагами, что свидетельствует о повышенном потенциале к диссеминации эутопического эндометрия у этих пациенток.

Среднее значение экспрессии NF-kβ p65 в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 2,54 балла (медиана 3, интерквартильный размах 2—3), среднее значение экспрессии NF-kβ p65 в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения — 3,5 балла (медиана 4, интерквартильный размах 3—4). Экспрессия NF-kβ p65 в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток основной группы достоверно ниже по сравнению с пациентками из группы сравнения (р=0,0082, тест Манна—Уитни). Среднее значение экспрессии NF-kβ p65 в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 4,5 балла (медиана 5, интерквартильный размах 4—5), среднее значение экспрессии NF-kβ p65 в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения — 4,79 балла (медиана 5, интерквартильный размах 5—5) (р=0,267, тест Манна—Уитни) (см. таблицу, рисунок).

Среднее значение экспрессии COX-2 в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 0,231 балла (медиана 0, интерквартильный размах 0—0), среднее значение экспрессии COX-2 в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения значительно выше — 1,381 балла (медиана 1, интерквартильный размах 1—2). Экспрессия СОХ-2 в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток основной группы достоверно ниже по сравнению с пациентками группы сравнения (р=0,00245, тест Манна—Уитни). Экспрессия COX-2 в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ статистически значимо не различается между обследуемыми группами пациенток (р=0,411, тест Манна—Уитни) (см. таблицу, рисунок).

По данным нашего исследования, экспрессия NF-kβ p65 и СОХ-2 достоверно понижена в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ у пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ. NF-kβ — это димерный фактор транскрипции, способствующий экспрессии более 150 генов, вовлеченных в клеточные процессы иммунного ответа, воспалительный процесс, клеточную адгезию, ангиогенез, пролиферацию и апоптоз [21, 22]. Как известно, проангиогенез, провоспалительная и антиапоптотическая активность являются важными звеньями в патогенезе эндометриоза и связаны с половыми стероидами, выделяемыми яичниками [11]. NF-kβ также является ключевым транскрипционным фактором регуляции экспрессии RANTES, индуцирует провоспалительные цитокины и хемокины, и его экспрессия обычно ограничена в эндометриальной ткани [23]. Данные других исследований относительно иммунореактивности NF-kβ неоднозначны. F. Shen и соавт. [5] обнаружили, что иммунореактивность NF-kβ p65 достоверно повышена в группе пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ по сравнению с группой пациенток без рецидива ЭКЯ. A. Han и соавт. [11] обнаружили достоверное снижение экспрессии NF-kβ p65 (p=0,036) в группе пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ по сравнению с группой пациенток без рецидива. Авторы считают, что иммунореактивность NF-kβ р65 должна быть повторно исследована в дальнейшем с привлечением более репрезентативных выборок пациенток. Поскольку NF-kβ p65 как фактор транскрипции участвует в регуляции экспрессии СОХ-2 и ряда других генов, регулирующих пролиферацию, апоптоз, ангиогенез, продукцию цитокинов и процессы инвазии, его иммунореактивность является биомаркером экспрессии СОХ-2.

COX-2 — это фермент, который влияет на скорость простагландинового синтеза и играет важную роль в воспалительных процессах и пролиферации при эндометриозе [21, 24]. Естественно, что факторы, регулирующие простагландиновый синтез, становятся потенциальными кандидатами для прогнозирования рецидивирования после хирургического лечения. В недавно проведенных исследованиях [25] доказано, что СОХ-2 регулирует выживаемость, миграцию и инвазию эндометриальных клеток через множество механизмов. Неудивительно, что селективные ингибиторы СОХ-2, как было показано, препятствуют имплантации эутопического эндометрия в эктопических сайтах, подавляют рост ксенотрансплантатов эндометриоза, индуцируют регресс аутологичных эндометриоидных трансплантатов и эффективны при лечении болевого синдрома, связанного с эндометриозом [24]. Однако А. Fagotti и соавт. [26] сообщили, что экспрессия COX-2 не коррелирует с клинико-патологическими характеристиками и симптомами у пациенток с эндометриозом. Данные литературы относительно СОХ-2 также неоднозначны. По данным L. Yuan и соавт. [24], уровень экспрессии COX-2 достоверно более высокий в группе пациенток с рецидивом ЭКЯ по сравнению с группой пациенток без рецидивирования и контрольной группой. По данным других исследований [26, 27], повышенная экспрессия СОХ-2 характерна для подгруппы пациенток без рецидива ЭКЯ или с более длительным безрецидивным периодом по сравнению с подгруппой пациенток с рецидивом ЭКЯ.

NF-kβ p65 и СОХ-2 являются потенциальными биомаркерами рецидивирования ЭКЯ, однако иммунореактивность NF-kβ p65 и СОХ-2 должна быть повторно переоценена несколькими исследователями.

Среднее значение экспрессии β-катенина в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 2,5 балла (медиана 3, интерквартильный размах 2—3), среднее значение экспрессии β-катенина в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения — 1,59 балла (медиана 2, интерквартильный размах 1—2). Экспрессия β-катенина в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток основной группы достоверно выше по сравнению с пациентками группы сравнения (р=0,017, тест Манна—Уитни). Среднее значение экспрессии β-катенина в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ составило 2,92 балла (медиана 3, интерквартильный размах 3—3), среднее значение экспрессии β-катенина в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ от пациенток из группы сравнения — 2,9 балла (медиана 3, интерквартильный размах 3—3) (р=0,943, тест Манна—Уитни) (см. таблицу, рисунок).

По данным нашего исследования, экспрессия β-катенина достоверно повышена в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ у пациенток с рецидивирующим течением ЭКЯ. β-Катенин — главный структурный компонент межклеточных адгезионных соединений (адгезионные контакты), которые очень важны для поддержания эпителиальных слоев. β-Катенин действует как ключевой транскрипционный фактор в каноническом Wnt/β-катениновом сигнальном пути. Активация Wnt-пути приводит к дефосфорилированию β-катенина и его накоплению в ядре клетки с последующей активацией ряда генов. Предположительно существует связь между гипоксией и β-катениновым сигнальным путем в патогенезе эндометриоза. Показано, что гипоксия/HIF-1α активирует β-катениновый сигнальный путь, способствуя клеточной миграции и инвазии в процессе развития эндометриоза [3, 6, 28].

Иммуногистохимическая разница экспрессии ряда исследуемых маркеров может выступить в качестве основы для дальнейшего исследования этих маркеров как предикторов рецидивирования ЭКЯ после оперативного лечения. Так, достоверно отличается экспрессия PR-α (повышена) и Ki-67 (понижена) в эпителиальном компоненте капсулы ЭКЯ у пациенток с рецидивом ЭКЯ. Экспрессия NF-kβ p65 и СОХ-2 достоверно понижена в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ, а экспрессия β-катенина достоверно повышена в стромальном компоненте капсулы ЭКЯ у пациенток с рецидивом ЭКЯ. Иммуногистохимическое исследование данных факторов может помочь определять пациенток с высоким риском рецидива ЭКЯ после оперативного лечения. Дальнейшие исследования этих факторов также позволят изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе патогенеза рецидивирования ЭКЯ, что позволит воздействовать на эти механизмы для устранения фундаментальных причин рецидива данного заболевания.

Результаты, полученные в ходе данного исследования, легли в основу заявки на патент «Способ прогнозирования рецидивирования эндометриоидных кист яичников после оперативного лечения при помощи иммуногистохимических маркеров» от 20.12.17 (регистрационный № 2017144808).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.Ю.П., А.В.А., Л.В.А.

Сбор и обработка материала — Е.Ю.П., А.В.А., Н.В.З.

Статистическая обработка данных — Е.Ю.П.

Написание текста — Е.Ю.П.

Редактирование — А.В.А., Л.В.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Пшеничнюк Екатерина Юрьевна — аспирант отд-ния оперативной гинекологии; https://orcid.org/0000-0003-3805-3530; e-mail: e.pshenichnyuk@mail.ru