Эпителий эктодермального происхождения, выстилающий полость носа, также называемый шнейдериановой мембраной, в соответствии с современной классификацией ВОЗ [1] является источником трех морфологических типов шнейдериановой папилломы: инвертированной, онкоцитарной и экзофитной. Истинные инвертированные папилломы (ИП) характеризуются инвагинацией покрывающего слизистую оболочку эпителия — многорядного цилиндрического мерцательного, переходного, многослойного плоского в подлежащую строму [2]. Инвагинаты имеют форму булавовидных погружений с дихотомическим ветвлением и формированием структур, имеющих вид протоков. При этом следует отметить, что эпителиальные инвагинаты, являясь продолжением покровного эпителия, всегда имеют просвет и окружены базальной мембраной, что не позволяет говорить об их истинной инвазии. В настоящее время ИП полости носа относят к группе доброкачественных опухолей с местно-деструирующим ростом [1].
Считают, что ИП могут развиваться на основе фиброзно-отечных полипов [3, 4], рассматривается также участие инфекционных факторов — вирусов [5, 6] и возникновение их de novo [7].
Вирусная теория происхождения опухоли базируется на большом фактическом материале, а именно регулярном обнаружении в клетках различных опухолей вирусной ДНК, существовании в природе сходных вирусов, способных инициировать рост опухолей у экспериментальных животных, а также эпидемиологических данных, подтверждающих связь между опухолевым процессом и наличием вирусного материала в клетках опухоли [8]. Так, на сегодняшний момент не вызывает сомнения участие вируса папилломы человека (ВПЧ) в этиологии ювенильного респираторного папилломатоза гортани [9, 10] и рака шейки матки [11]. Первое предположение о вирусной этиологии ИП принадлежит О. Jarvi [12], позднее эту точку зрения поддержали ряд исследователей [5, 13, 14]. Другие исследователи [15–17] отрицают вирусную этиологию ИП, так как они не смогли обнаружить следов деятельности вируса ни в ядре, ни в цитоплазме.
Несмотря на широкое использование иммуногистохимических методов и гибридизации in situ, вопрос о связи ИП с ВПЧ так и не решен. Так, в большинстве работ с применением иммунопероксидазного метода в ИП вирус ВПЧ не обнаружен, однако наличие генома ВПЧ в ИП доказано методом гибридизации in situ и ПЦР, при этом наиболее часто выявляли ВПЧ 6-го и 11-го типов, реже — ВПЧ 16-го и 18-го и исключительно редко — ВПЧ 57-го типа [5, 18]. Частота обнаружения вируса варьировалась от 0 до 100%. Поэтому остается неясным, является ли вирус ВПЧ этиологическим фактором или сопровождает И.П. Тем не менее в последнее время появляется все больше работ [11, 19], в которых исследуются этапы взаимодействия ВПЧ с эпителиальными клетками и участие в канцерогенезе.
Цель исследования — определить возможное присутствие ДНК вирусов Эпштейна—Барр и ВПЧ 6, 11, 16, 18, 35, 43-го типа в ИП, а также ассоциированной с ней синоназальной карциноме.
Материал и методы
Работа выполнена на операционном материале, полученном при наблюдении 76 случаев ИП и 4 — синоназального рака, развившихся на фоне ИП, 45 проб отобрано для постановки ПЦР.
ПЦР in Real time. Выделение ДНК проводили из парафиновых срезов с использованием набора Экстракт ДНК FFPE (ООО HOMOTEK, Москва) согласно инструкции. Определение концентрации выделенной ДНК человека подтверждали при помощи метода количественной ПЦР в реальном времени с использованием тест-системы для выявления гена сурвивина человека для научного применения (ООО «Нанодиагностика», Москва). Для оценки фрагментации ДНК разработан подход на основе амплификации фрагментов с разной длиной ампликонов. Для этой цели использованы 3 пары праймеров для амплификации гена сурвивина геномной ДНК человека с длиной ампликона 95, 213 и 317 пар оснований (ООО «Нанодиагностика», Москва). Каждую систему праймеров предварительно калибровали на нефрагментированной ДНК человека с известной концентрацией. Проведен скрининг 46 образцов с помощью наборов для выявления ВПЧ 6, 11-го, ВПЧ 16, 35-го, ВПЧ 18, 45-го типов методом ПЦР в реальном времени с Такман-зондами (ООО «Нанодиагностика», Россия). Исследование проводили на приборе CFX-96 («Bio-Rad», США) по следующей программе: 5 мин — 95 °C; 40 циклов: 10 с — 95 °C, 20 с — 60 °C, 10 с — 70 °C. Каждый образец анализировали в двух независимых экспериментах с двумя повторениями в каждом. Результаты обрабатывали при помощи программы CFX-Manager («Bio-Rad», США).
Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ). По результатам ПЦР-исследования отобрано 15 образцов с наименьшими пороговыми циклами (Ct) к ВПЧ различных типов. С выбранных блоков (15 наблюдений) готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла (X-tra Adhesiva, «Leica Biosystem») и высушивали при температуре 37 °C в течение 12 ч. Восстановление антигенной активности проводили в цитратном буфере Epitope Retrival Solution, рН 9,0 («Leica Biosystem») при температуре 120 °C в течение 20 мин и последующем остывании 90 мин. В качестве первичных антител использовали моноклональные кроличьи антитела к HPV L1 (клон: K1H8) фирмы «Dako» в разведении 1:50. В качестве детекционной системы применяли Novolink Polymer Detection System («Leica Biosystem»), в качестве хромогена — диаминобензидин. Реакцию оценивали полуколичественным методом по интенсивности окрашивания: отсутствующая (0), слабая (+), умеренная (++) и значительная (+++) экспрессия.
Результаты
Из 45 исследуемых образцов ИП вследствие выраженной деградации ДНК лишь 38 проб оказались пригодными для дальнейшего анализа. В 13 образцах ИП ДНК ВПЧ не найдено, в 20 случаях обнаружен ВПЧ 6-го типа в 3 из них выявлен также 11-й тип ВПЧ, в 1 — только ВПЧ 11-го типа. ВПЧ 16, 18, 35, 45-го типов и вирус Эпштейна—Барр не обнаружен ни в одном из наблюдений ИП (табл. 1).
Только в 1 из 4 случаев синоназальной карциномы на фоне ИП обнаружен ВПЧ 16-го и 35-го типов. Вирус Эпштейна—Барр не найден (табл. 2).
При ИГХИ в тканевых срезах, полученных из образцов с пороговым циклом 18 Ct ДНК ВПЧ 6-го типа, во всех полях зрения определяли выраженную иммунопозитивную цитоплазматическую реакцию в виде гранул в лимфоцитах и клетках гистиоцитарно-макрофагального ряда (рис. 1, а),
В одном случае синоназального рака, ассоциированного с ИП, отмечали гранулярную цитоплазматическую иммунопозитивную реакцию в небольших группах базальных и супрабазальных клеток, а также в единичных поверхностных эпителиоцитах (рис. 2).
Обсуждение
Следует отметить, что, несмотря на высокую чувствительность и достоверность ПЦР, этот метод в силу особенностей выделения вирусной ДНК из образца, предполагающего полное разрушение клеточных и тканевых структур, не позволяет судить о наличии вирусной ДНК в той или иной клетке (эпителий, клетки крови, стромальные элементы), хотя является прямым доказательством наличия ДНК ВПЧ в исследуемом образце. В отличие от ПЦР иммуногистохимический метод исследования, основанный на реакции антиген—антитело, направлен на выявление различных белковых продуктов вируса, в частности позднего капсидного белка ВПЧ L1. Преимуществом ИГХИ является возможность связать результаты с топикой процесса, т. е. локализовать антиген.
Проведя сопоставление этих двух методов, мы определили значение порогового цикла, равного 27,06 Ct, при котором можно выявить капсидный белок HPV L1 в эпителиальных и гистиоцитарно-макрофагальных клетках стромы, используя ИГХИ. При ПЦР-диагностике в 59% случаев (20 образцов) обнаружен ВПЧ 6-го типа. В 18 (86%) из 21 случая изученных ПЦР-положительных ИП концентрация ДНК ВПЧ была низкой, с циклом боле 30 Ct. Присутствие вируса Эпштейна—Барр, а также ВПЧ 16, 18 35, 45-го типа при ПЦР-диагностике во всех случаях ИП дало отрицательные результаты. Другими словами, высокое значение порогового цикла Ct указывает на крайне низкую концентрацию ДНК ВПЧ в исследуемом образце и, следовательно, на крайне низкое наличие белковых продуктов вируса или их полное отсутствие. По нашему мнению, это обстоятельство может объяснить иммунонегативную реакцию в различных исследовательских работах [20]. Учитывая вышеизложенное, можно предположить, что ВПЧ 6-го типа является «сателлитом» ИП, поскольку прямых доказательств участия ВПЧ 6-го типа в патогенезе ИП не найдено. Кроме того, существуют работы, показывающие наличие ВПЧ в неизмененной слизистой оболочке полости рта [21]. Что касается синоназальной карциномы на фоне ИП, то ПЦР выявила ВПЧ 16-го и 35-го типов только в 1 из 4 наблюдений. При ИГХИ в этом же случае синоназального рака, ассоциированного с ИП, получена иммунопозитивная цитоплазматическая реакция HPV L1 с локализацией в базальных и парабазальных эпителиоцитах опухоли (см. рис. 2). Известно, что 16-й и 35-й типы ВПЧ относятся к высокоонкогенной группе. В нашем материале эти типы ВПЧ выявлены с помощью ПЦР и ИГХИ только в 1 случае из 4 синоназального рака. Это обстоятельство не снимает с повестки дня участие данных типов ВПЧ в этиологии синоназального рака, ассоциированного с ИП.
Заключение
Учитывая низкую концентрацию ВПЧ, выявленную только для 6-го и 11-го типов, а также иммуногистохимическое обнаружение HPV L1 в лимфоцитах и клетках гистиоцитарно-макрофагального ряда элементов опухоли и отдельных базальных эпителиальных клетках в единичных случаях, можно предположить, что вирус ВПЧ не играет решающей роли в качестве этиологического фактора инвертированной папилломы. В синоназальной карциноме, ассоциированной с инвертированной папилломой, лишь в 1 случае с помощью ПЦР обнаружен ВПЧ 16-го и 35-го типов, что делает преждевременным утверждение об исключительной роли этого вируса в этиологии данного рака. С учетом противоречивых данных литературы наши результаты не снимают с повестки дня участие данных типов ВПЧ в патогенезе этого типа рака. Предполагаем, что ВПЧ 16-го и 35-го типов принимают участие в развитии инвертированной папилломы в сторону злокачественной трансформации. Вирус Эпштейна—Барр не найден ни в одном случае инвертированной папилломы и синоназального рака с помощью ПЦР и ИГХИ. Результаты нашего исследования совпадают с данными, полученными другими авторами, которые сопоставляли результаты ПЦР при анализе ДНК ВПЧ в инвертированной папилломе и синоназальной карциноме с результатами гибридизации in situ [14].
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.А.Б.
Сбор и обработка материала — А.А.Б.
Написание текста — А.А.Б., В.П.Б.
Редактирование — А.А.Б., В.П.Б., Н.А.Д., О.В.К.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Бахтин Артур Александрович — канд. мед. наук, зав. отд-нием патологической анатомии; https://orcid.org/0000-0003-0232-0545; e-mail: lor-pathology@yandex.ru