Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Бахтин А.А.

ФГБУ «НКЦ оториноларингологии» ФМБА РФ, Москва, Россия

Быкова В.П.

Отдел заболеваний уха, лаборатория патологической анатомии ЛОР-органов НКЦ оториноларингологии ФМБА России

Дайхес Н.А.

Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России, Москва

Карнеева О.В.

Отделение оториноларингологии, отделение компьютерной томографии Научного центра здоровья детей РАМН, Москва

Вирусы папилломы человека и Эпштейна—Барр в патогенезе инвертированной папилломы и ассоциированной с ней синоназальной карциномы

Журнал: Архив патологии. 2018;80(4): 3‑8

Просмотров : 701

Загрузок : 16

Как цитировать

Бахтин А.А., Быкова В.П., Дайхес Н.А., Карнеева О.В. Вирусы папилломы человека и Эпштейна—Барр в патогенезе инвертированной папилломы и ассоциированной с ней синоназальной карциномы. Архив патологии. 2018;80(4):3‑8.
Bakhtin AA, Bykova VP, Daĭkhes NA, Karneeva OV. Human papillomavirus and Epstein-Barr virus in the pathogenesis of inverted papilloma and associated sinonasal carcinoma. Arkhiv Patologii. 2018;80(4):3‑8. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/patol20188043

Авторы:

Бахтин А.А.

ФГБУ «НКЦ оториноларингологии» ФМБА РФ, Москва, Россия

Все авторы (4)

Эпителий эктодермального происхождения, выстилающий полость носа, также называемый шнейдериановой мембраной, в соответствии с современной классификацией ВОЗ [1] является источником трех морфологических типов шнейдериановой папилломы: инвертированной, онкоцитарной и экзофитной. Истинные инвертированные папилломы (ИП) характеризуются инвагинацией покрывающего слизистую оболочку эпителия — многорядного цилиндрического мерцательного, переходного, многослойного плоского в подлежащую строму [2]. Инвагинаты имеют форму булавовидных погружений с дихотомическим ветвлением и формированием структур, имеющих вид протоков. При этом следует отметить, что эпителиальные инвагинаты, являясь продолжением покровного эпителия, всегда имеют просвет и окружены базальной мембраной, что не позволяет говорить об их истинной инвазии. В настоящее время ИП полости носа относят к группе доброкачественных опухолей с местно-деструирующим ростом [1].

Считают, что ИП могут развиваться на основе фиброзно-отечных полипов [3, 4], рассматривается также участие инфекционных факторов — вирусов [5, 6] и возникновение их de novo [7].

Вирусная теория происхождения опухоли базируется на большом фактическом материале, а именно регулярном обнаружении в клетках различных опухолей вирусной ДНК, существовании в природе сходных вирусов, способных инициировать рост опухолей у экспериментальных животных, а также эпидемиологических данных, подтверждающих связь между опухолевым процессом и наличием вирусного материала в клетках опухоли [8]. Так, на сегодняшний момент не вызывает сомнения участие вируса папилломы человека (ВПЧ) в этиологии ювенильного респираторного папилломатоза гортани [9, 10] и рака шейки матки [11]. Первое предположение о вирусной этиологии ИП принадлежит О. Jarvi [12], позднее эту точку зрения поддержали ряд исследователей [5, 13, 14]. Другие исследователи [15–17] отрицают вирусную этиологию ИП, так как они не смогли обнаружить следов деятельности вируса ни в ядре, ни в цитоплазме.

Несмотря на широкое использование иммуногистохимических методов и гибридизации in situ, вопрос о связи ИП с ВПЧ так и не решен. Так, в большинстве работ с применением иммунопероксидазного метода в ИП вирус ВПЧ не обнаружен, однако наличие генома ВПЧ в ИП доказано методом гибридизации in situ и ПЦР, при этом наиболее часто выявляли ВПЧ 6-го и 11-го типов, реже — ВПЧ 16-го и 18-го и исключительно редко — ВПЧ 57-го типа [5, 18]. Частота обнаружения вируса варьировалась от 0 до 100%. Поэтому остается неясным, является ли вирус ВПЧ этиологическим фактором или сопровождает И.П. Тем не менее в последнее время появляется все больше работ [11, 19], в которых исследуются этапы взаимодействия ВПЧ с эпителиальными клетками и участие в канцерогенезе.

Цель исследования — определить возможное присутствие ДНК вирусов Эпштейна—Барр и ВПЧ 6, 11, 16, 18, 35, 43-го типа в ИП, а также ассоциированной с ней синоназальной карциноме.

Материал и методы

Работа выполнена на операционном материале, полученном при наблюдении 76 случаев ИП и 4 — синоназального рака, развившихся на фоне ИП, 45 проб отобрано для постановки ПЦР.

ПЦР in Real time. Выделение ДНК проводили из парафиновых срезов с использованием набора Экстракт ДНК FFPE (ООО HOMOTEK, Москва) согласно инструкции. Определение концентрации выделенной ДНК человека подтверждали при помощи метода количественной ПЦР в реальном времени с использованием тест-системы для выявления гена сурвивина человека для научного применения (ООО «Нанодиагностика», Москва). Для оценки фрагментации ДНК разработан подход на основе амплификации фрагментов с разной длиной ампликонов. Для этой цели использованы 3 пары праймеров для амплификации гена сурвивина геномной ДНК человека с длиной ампликона 95, 213 и 317 пар оснований (ООО «Нанодиагностика», Москва). Каждую систему праймеров предварительно калибровали на нефрагментированной ДНК человека с известной концентрацией. Проведен скрининг 46 образцов с помощью наборов для выявления ВПЧ 6, 11-го, ВПЧ 16, 35-го, ВПЧ 18, 45-го типов методом ПЦР в реальном времени с Такман-зондами (ООО «Нанодиагностика», Россия). Исследование проводили на приборе CFX-96 («Bio-Rad», США) по следующей программе: 5 мин — 95 °C; 40 циклов: 10 с — 95 °C, 20 с — 60 °C, 10 с — 70 °C. Каждый образец анализировали в двух независимых экспериментах с двумя повторениями в каждом. Результаты обрабатывали при помощи программы CFX-Manager («Bio-Rad», США).

Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ). По результатам ПЦР-исследования отобрано 15 образцов с наименьшими пороговыми циклами (Ct) к ВПЧ различных типов. С выбранных блоков (15 наблюдений) готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла (X-tra Adhesiva, «Leica Biosystem») и высушивали при температуре 37 °C в течение 12 ч. Восстановление антигенной активности проводили в цитратном буфере Epitope Retrival Solution, рН 9,0 («Leica Biosystem») при температуре 120 °C в течение 20 мин и последующем остывании 90 мин. В качестве первичных антител использовали моноклональные кроличьи антитела к HPV L1 (клон: K1H8) фирмы «Dako» в разведении 1:50. В качестве детекционной системы применяли Novolink Polymer Detection System («Leica Biosystem»), в качестве хромогена — диаминобензидин. Реакцию оценивали полуколичественным методом по интенсивности окрашивания: отсутствующая (0), слабая (+), умеренная (++) и значительная (+++) экспрессия.

Результаты

Из 45 исследуемых образцов ИП вследствие выраженной деградации ДНК лишь 38 проб оказались пригодными для дальнейшего анализа. В 13 образцах ИП ДНК ВПЧ не найдено, в 20 случаях обнаружен ВПЧ 6-го типа в 3 из них выявлен также 11-й тип ВПЧ, в 1 — только ВПЧ 11-го типа. ВПЧ 16, 18, 35, 45-го типов и вирус Эпштейна—Барр не обнаружен ни в одном из наблюдений ИП (табл. 1).

Таблица 1. Пробы с умеренной и низкой степенью деградации ДНК. Группа инвертированных папиллом Примечание. Здесь и в табл. 2: зеленый — высокое содержание ДНК, желтый — среднее содержание, красный — очень низкое содержание, пустые ячейки — отрицательный результат.

Только в 1 из 4 случаев синоназальной карциномы на фоне ИП обнаружен ВПЧ 16-го и 35-го типов. Вирус Эпштейна—Барр не найден (табл. 2).

Таблица 2. Пробы с умеренной и низкой степенью деградации ДНК. Группа синоназальных раков на фоне инвертированных папиллом

При ИГХИ в тканевых срезах, полученных из образцов с пороговым циклом 18 Ct ДНК ВПЧ 6-го типа, во всех полях зрения определяли выраженную иммунопозитивную цитоплазматическую реакцию в виде гранул в лимфоцитах и клетках гистиоцитарно-макрофагального ряда (рис. 1, а),

Рис. 1. Иммунопозитивная цитоплазматическая реакция на HPV (clon: K1H8) в синоназальной инвертированной папилломе при различных концентрациях ДНК ВПЧ 6-го типа, определенной с помощью ПЦР. а — 18,00 Ct; б — 18,00 Сt; в — 27,06 Ct; г — 34,34 Ct. Иммунопероксидазный метод. DAB-chromogen. х400.
а также умеренную реакцию в единичных базальных клетках эпителиального пласта ИП (см. рис. 1, б). В срезах образцов с пороговым циклом 27,06 Ct ДНК ВПЧ 6-го типа весь эпителиальный пласт был иммунонегативен с сохранением иммунореактивности в клетках гистиоцитарно-макрофагального ряда (см. рис. 1, в). При пороговом цикле ДНК ВПЧ 6-го типа, равном 34,34 Ct и более, все поля зрения были иммунонегативны к HPV L1 (см. рис. 1, г).

В одном случае синоназального рака, ассоциированного с ИП, отмечали гранулярную цитоплазматическую иммунопозитивную реакцию в небольших группах базальных и супрабазальных клеток, а также в единичных поверхностных эпителиоцитах (рис. 2).

Рис. 2. Иммунопозитивная цитоплазматическая реакция на HPV (clon: K1H8) в синоназальной карциноме, ассоциированной с инвертированной папилломой. Иммунопероксидазный метод. DAB-chromogen. х400.

Обсуждение

Следует отметить, что, несмотря на высокую чувствительность и достоверность ПЦР, этот метод в силу особенностей выделения вирусной ДНК из образца, предполагающего полное разрушение клеточных и тканевых структур, не позволяет судить о наличии вирусной ДНК в той или иной клетке (эпителий, клетки крови, стромальные элементы), хотя является прямым доказательством наличия ДНК ВПЧ в исследуемом образце. В отличие от ПЦР иммуногистохимический метод исследования, основанный на реакции антиген—антитело, направлен на выявление различных белковых продуктов вируса, в частности позднего капсидного белка ВПЧ L1. Преимуществом ИГХИ является возможность связать результаты с топикой процесса, т. е. локализовать антиген.

Проведя сопоставление этих двух методов, мы определили значение порогового цикла, равного 27,06 Ct, при котором можно выявить капсидный белок HPV L1 в эпителиальных и гистиоцитарно-макрофагальных клетках стромы, используя ИГХИ. При ПЦР-диагностике в 59% случаев (20 образцов) обнаружен ВПЧ 6-го типа. В 18 (86%) из 21 случая изученных ПЦР-положительных ИП концентрация ДНК ВПЧ была низкой, с циклом боле 30 Ct. Присутствие вируса Эпштейна—Барр, а также ВПЧ 16, 18 35, 45-го типа при ПЦР-диагностике во всех случаях ИП дало отрицательные результаты. Другими словами, высокое значение порогового цикла Ct указывает на крайне низкую концентрацию ДНК ВПЧ в исследуемом образце и, следовательно, на крайне низкое наличие белковых продуктов вируса или их полное отсутствие. По нашему мнению, это обстоятельство может объяснить иммунонегативную реакцию в различных исследовательских работах [20]. Учитывая вышеизложенное, можно предположить, что ВПЧ 6-го типа является «сателлитом» ИП, поскольку прямых доказательств участия ВПЧ 6-го типа в патогенезе ИП не найдено. Кроме того, существуют работы, показывающие наличие ВПЧ в неизмененной слизистой оболочке полости рта [21]. Что касается синоназальной карциномы на фоне ИП, то ПЦР выявила ВПЧ 16-го и 35-го типов только в 1 из 4 наблюдений. При ИГХИ в этом же случае синоназального рака, ассоциированного с ИП, получена иммунопозитивная цитоплазматическая реакция HPV L1 с локализацией в базальных и парабазальных эпителиоцитах опухоли (см. рис. 2). Известно, что 16-й и 35-й типы ВПЧ относятся к высокоонкогенной группе. В нашем материале эти типы ВПЧ выявлены с помощью ПЦР и ИГХИ только в 1 случае из 4 синоназального рака. Это обстоятельство не снимает с повестки дня участие данных типов ВПЧ в этиологии синоназального рака, ассоциированного с ИП.

Заключение

Учитывая низкую концентрацию ВПЧ, выявленную только для 6-го и 11-го типов, а также иммуногистохимическое обнаружение HPV L1 в лимфоцитах и клетках гистиоцитарно-макрофагального ряда элементов опухоли и отдельных базальных эпителиальных клетках в единичных случаях, можно предположить, что вирус ВПЧ не играет решающей роли в качестве этиологического фактора инвертированной папилломы. В синоназальной карциноме, ассоциированной с инвертированной папилломой, лишь в 1 случае с помощью ПЦР обнаружен ВПЧ 16-го и 35-го типов, что делает преждевременным утверждение об исключительной роли этого вируса в этиологии данного рака. С учетом противоречивых данных литературы наши результаты не снимают с повестки дня участие данных типов ВПЧ в патогенезе этого типа рака. Предполагаем, что ВПЧ 16-го и 35-го типов принимают участие в развитии инвертированной папилломы в сторону злокачественной трансформации. Вирус Эпштейна—Барр не найден ни в одном случае инвертированной папилломы и синоназального рака с помощью ПЦР и ИГХИ. Результаты нашего исследования совпадают с данными, полученными другими авторами, которые сопоставляли результаты ПЦР при анализе ДНК ВПЧ в инвертированной папилломе и синоназальной карциноме с результатами гибридизации in situ [14].

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.А.Б.

Сбор и обработка материала — А.А.Б.

Написание текста — А.А.Б., В.П.Б.

Редактирование — А.А.Б., В.П.Б., Н.А.Д., О.В.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Бахтин Артур Александрович — канд. мед. наук, зав. отд-нием патологической анатомии; https://orcid.org/0000-0003-0232-0545; e-mail: lor-pathology@yandex.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail