Известно, что для миокарда предсердий пациентов с фибрилляцией предсердий (ФП) характерны структурные изменения, так или иначе связанные с нарушением межклеточных взаимодействий, изоляцией отдельных кардиомиоцитов (КМЦ) и групп КМЦ, что отрицательно влияет на электрическую проводимость миокарда. Основными процессами, связанными с развитием ФП, по данным литературы, являются фиброз и липоматоз миокарда [1—7], а также изолированный амилоидоз предсердий [4, 8—12]. Распространенность в интерстиции депозитов амилоида при пароксизмальной фибрилляции предсердий (ПФП) связана с достоверным увеличением объема левого предсердия (ЛП) [12] — одного из предикторов перехода ФП из пароксизмальной формы в персистирующую [13, 14]. Вероятность подобного перехода у пациентов с подтвержденной формой ПФП спустя 5 лет составляет, по разным данным, от 24,7% [13] до 35,3% [14].
Характерным морфологическим признаком аритмогенного ремоделирования миокарда предсердий на клеточном уровне считается гипертрофия КМЦ [1, 3, 4, 6, 7, 15, 16] и частичная утрата в них миофибрилл (миолиз) — явление, подробно описанное на гистологическом и ультраструктурном уровнях [1, 2, 6, 7, 16—18]. Феномен утраты миофибрилл ранее трактовался как дегенеративное изменение структуры КМЦ [15], позже, когда сходная картина была продемонстрирована в миокарде с экспериментально индуцированной ФП у коз, его стали рассматривать в качестве приспособительного, сопровождающегося частичным понижением уровня дифференцировки КМЦ [17, 18]. Об этом свидетельствует обнаруженная в КМЦ с частичной утратой миофибрилл активация белков, присутствующих на ранних этапах дифференцировки миоцитов, например скелетного α-актина [18] и гладкомышечного α-актина [17].
В настоящей работе планируется оценить морфологические изменения в миокарде ушка левого предсердия (УЛП) и ушка правого предсердия (УПП) у пациентов с тремя формами ФП и проанализировать у них корреляции между клиническими и морфологическими параметрами.
Материал и методы
Исследован миокард УЛП и УПП у 55 пациентов с ФП, полученный интраоперационно во время радиочастотной модификации операции «Лабиринт» [19]. В зависимости от клинической формы ФП пациенты были распределены на 3 группы: с пароксизмальной формой ФП (ПФП, n=11), персистирующей формой ФП (ПРФП, n=19) и длительно существующей персистирующей формой фибрилляции предсердий (ДПФП, n=23). Средний возраст пациентов с ФП составил 55,1±9,36 года, из 55 пациентов с ФП 42 (63,6%) мужчины, а 24 (36,4%) женщины. Аритмический анамнез у пациентов с ФП составил в среднем 6,92±6,4 года. Методом компьютерной томографии у больных определяли объем ЛП с учетом ушка и средний переднезадний размер ЛП. С целью выявления параметров сократительной функции левого желудочка (ЛЖ) проводили трансторакальное ЭхоКГ сердца: фракция выброса (ФВ) ЛЖ составила в среднем 61,46±7,3%. В качестве сопутствующей патологии у ряда пациентов с ФП обнаружена артериальная гипертензия II—III степени и ишемическая болезнь сердца (табл. 1).
В группу сравнения были включены пациенты с хронической расслаивающей аневризмой аорты, пороком и недостаточностью аортального клапана с синусовым ритмом (СР, n=12), не имевшие в анамнезе Ф.П. Пациентам группы сравнения произведено протезирование аортального клапана (n=8) или дуги аорты (n=4).
Гистологическое исследование. Проведено исследование морфологии миокарда УЛП и УПП. Фрагменты миокарда, полученные интраоперационно, фиксировали в забуференном 4% формалине, обрабатывали по стандартной методике, заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и полуколичественно по 4-балльной шкале оценивали распространенность липоматоза в миокарде предсердий: 0 — жировые клетки отсутствуют; 1 — встречаются единичные жировые клетки; 2 — единичные жировые клетки или небольшие их скопления встречаются в нескольких полях зрения; 3 — имеются крупные скопления жировых клеток в интерстиции (рис. 1, а—г). Препараты, окрашенные Масcон-трихромом (Bio-Optica 04−010802), фотографировали с помощью цифровой камеры (Leica DFC 300FX) при увеличении 200. Далее с использованием морфометрической программы ImagePro на всех полях зрения оценивали процент фиброза, при этом оптически пустые зоны, не содержащие ткань, исключали из измерений. Вариабельность интерстициального и периваскулярного фиброза миокарда предсердий у пациентов с ФП представлена на рис. 2, а—г.
Для выявления амилоида парафиновые срезы окрашивали Сириусом красным (BioVitrum, 21−040) и полуколичественно по 5-балльной шкале оценивали содержание фибрилл амилоида: 0 — отложения амилоида отсутствуют; 1 — отложения амилоида отмечены вокруг единичных КМЦ; 2 — вокруг небольших групп; 3 — вокруг примерно половины КМЦ и единичных сосудов; 4 — вокруг значительной части КМЦ и сосудов.
Иммуногистохимическое исследование. На парафиновых срезах миокарда предсердий проводили двойное иммуноокрашивание с использованием первичных моноклональных антител к предсердному натрийуретическому пептиду (atrial natriuretic peptide, ANP, CBL66, «Chemicon») и десмину («Abcam», ab32362). Срезы обрабатывали 5% раствором бычьего сывороточного альбумина («Sigma-Aldrich»), инкубировали со смесью первичных антител в соотношении 1:1, а затем со смесью вторичных антител (1:1), меченных флюорохромами Alexa 488 и 546 («Invitrogen»). Ядра докрашивали DAPI («Sigma»). Препараты исследовали при помощи конфокального микроскопа Leica TCS SPE. На препаратах регистрировали ANP+-содержащие специфические предсердные гранулы, а также диффузно-расположенные в интерстициальном пространстве ANP+-амилоидные массы.
Электронно-микроскопическое исследование. Для приготовления полутонких и ультратонких срезов небольшие фрагменты миокарда фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида и 1% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4), дофиксировали в 1,5% растворе четырехокиси осмия, обезвоживали, заливали в аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, исследовали под электронным микроскопом Philips CM100. Полутонкие срезы окрашивали по методу ШИК с докраской метиленовым синим. На полутонких продольных срезах, проходящих через ядро, не менее чем в 50 КМЦ для каждого больного под световым микроскопом (об. ×100) измеряли диаметр и длину КМЦ. КМЦ считали гипертрофированными, если их диаметр превышал 15 мкм [15]. В этих же КМЦ полуколичественно по 4-балльной шкале определяли выраженность зон саркоплазмы, свободных от миофибрилл: зоны миолиза занимали менее 10% (0 баллов), 10—50% (1 балл), 50% (2 балла) и более 50% (3 балла) площади среза клетки.
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы Statistica 8.0 («Statistica software»). Количественные данные представляли в виде среднего значения со стандартным отклонением (mean±SD); качественные переменные представляли в виде медианы с указанием минимальных и максимальных значений переменной (min—max) или выражали в процентах. Соответствующие клинические, эхокардиографические и морфометрические данные пациентов разных групп сравнивали с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни, достоверность различий определяли при p<0,05. В каждой группе определяли взаимосвязь параметров с использованием непараметрического коэффициента корреляции Спирмена при уровне значимости p<0,05 (значения r и p приведены в табл. 3).
Результаты и обсуждение
Исследование миокарда предсердий выявило признаки его структурного ремоделирования во всех группах пациентов. Как правило, изменения морфологии миокарда предсердий носили очаговый характер. Липоматоз разной степени выраженности регистрировали в миокарде УЛП у 50—54,5% пациентов с ФП и у 33,3% пациентов с СР, а в миокарде УПП — у 10,5—30% пациентов с ФП и у 20% пациентов с СР (табл. 2). В интерстиции миокарда предсердий регистрировали как единичные жировые клетки, так и крупные их скопления (см. рис. 1, а—г). Кроме того, в ряде случаев обнаружен очаговый периваскулярный фиброз, в других случаях — диффузный интерстициальный фиброз, который изолировал отдельные КМЦ и группы КМЦ (см. рис. 2, а—г). Увеличение интерстициального и периваскулярного фиброза наблюдали как у пациентов всех групп с ФП, где фиброз достигал в среднем 39,8—50,3% (УЛП) и 44,4—50,3% (УПП), так и в миокарде у пациентов группы сравнения без достоверных различий между УЛП и УПП в каждой из групп (см. табл. 2). Степень интерстициального фиброза в миокарде УПП и УЛП не коррелировала с возрастом пациентов с ФП, так же как описано другими авторами [3, 20]. В настоящем исследовании процент фиброза в УЛП у пациентов с ФП не отличался от такового в группе сравнения, а в миокарде УПП у пациентов с ФП доля фиброза даже была достоверно ниже, чем в группе с СР (p<0,05; см. табл. 2), в отличие от описанного ранее увеличения фиброза миокарда предсердий у пациентов с ДПФП по сравнению с ПФП и СР [4] и у пациентов с ПФП и постоянной ФП по сравнению с пациентами без ФП в анамнезе [5]. Предполагаем, что отсутствие различий в выраженности фиброза в миокарде предсердий при ФП по сравнению с группой без ФП и патологией аорты/аортального клапана, выявленное в работе, объясняется тем, что морфологическая перестройка предсердий является следствием гемодинамической перегрузки миокарда и не связана непосредственно с инициацией Ф.П. Подобным образом продемонстрировано сходное содержание коллагена I и III типов в миокарде предсердий у пациентов с ДПФП и пациентов с ИБС или клапанной патологией [21].
По данным разных авторов, фиброз в миокарде предсердий при ФП может составлять от 10,4 до 40% [1, 5, 6, 8, 20, 22] в зависимости от формы ФП и методов оценки. Процент фиброза в миокарде предсердий возрастает у пациентов с постоянной ФП и недостаточностью митрального клапана [3, 16], у пациентов с ПРФП по сравнению с группами с ПФП и СР [20], в 2,5 раза у пациентов с ПРФП и ДПФП [22], в 3—5 раз у пациентов с ПФП и постоянной ФП по сравнению с пациентами без ФП в анамнезе [5]. Известно также, что в миокарде предсердий у пациентов с ПРФП отмечены увеличение объемной фракции коллагена I типа [23] и значительная активация синтеза коллагена I и III типов по сравнению с пациентами с СР [24].
В настоящем исследовании отложение амилоидных масс регистрировали в миокарде УЛП и УПП у 40—55% пациентов с разными формами ФП и в миокарде УПП у 25% пациентов с СР (см. рис. 2). Амилоидоз выявляли окрашиванием препаратов сириусом красным (рис. 3, а), а также на полутонких срезах ШИК-метиленовым синим (рис. 3, б). Депозиты амилоида, как правило, располагались по внешней границе сарколеммы КМЦ и вокруг мелких интрамиокардиальных сосудов. При электронно-микроскопическом исследовании обнаружено, что амилоидные массы представлены скоплением прямых, неветвящихся, хаотично расположенных тонких фибрилл диаметром 8—10 нм, локализованных в интерстициальном пространстве по ходу базальной мембраны КМЦ (рис. 3, в), в расширенных каналах Т-системы КМЦ (см. рис. 3, г), а также под эндотелиоцитами небольших интрамиокардиальных сосудов (рис. 3, д). Подобная ультраструктурная картина описана ранее в работе К. Thiedemann, V. Ferrans [15] у пациентов с ФП и митральным пороком в интерстиции ЛП, в котором, помимо коллагеновых и эластических волокон, наблюдали скопление микрофибрилл, соответствующих по ультраструктурным характеристикам фибриллам амилоида. Фибриллы располагались в расширенных каналах Т-системы КМЦ [4, 25—27], вдоль утолщенной базальной мембраны КМЦ и препятствовали формированию межклеточных контактов между КМЦ [15, 27]. Предполагается, что секреция и полимеризация фибрилл амилоида могут происходить в саркоплазме КМЦ [26].
Проведенное иммуноокрашивание препаратов миокарда с помощью специфических антител к предсердному натрийуретическому пептиду (ANP) определило, что белок амилоида был представлен фибриллярной формой ANP, характерной для изолированной формы амилоидоза предсердий [8, 10, 25, 26, 28, 29]. ANP-позитивные депозиты амилоида располагались по периметру миоцитов, в то время как в саркоплазме КМЦ, помимо четко очерченных ANP+ мелких предсердных гранул, регистрировали слабое диффузное иммуноокрашивание амилоидных масс, локализованных псевдовнутриклеточно в инвагинациях Т-системы КМЦ (рис. 3, е, ж). Анализ распространенности изолированного амилоидоза предсердий у пациентов с ФП разных возрастных групп (рис. 4) подтвердил данные литературы о его преобладании у пациентов старшего возраста [8, 29, 30]. В группе с ПФП депозиты амилоида чаще встречали у пациентов с длительным анамнезом ФП (см. табл. 3), подобная зависимость ранее продемонстрирована для пациентов с хронической ФП и ревматическим заболеванием клапанов [9]. У пациентов с ПРФП и ДПФП выраженность амилоидоза обратно коррелировала с долей фиброза (см. табл. 3), что, по-видимому, объяснялось конкуренцией между изолированным амилоидозом предсердий и фиброзом, ранее описанной C. Röcken и соавт. [8]. Так же, как и ряд авторов [8, 9, 29, 30], мы наблюдали отложения амилоида чаще в миокарде УЛП женщин, чем мужчин при ПРФП и ДПФП (см. табл. 3).
Надо отметить, что из-за небольшого размера биоптатов и очагового характера изменений корректное сопоставление полученных результатов о выраженности фиброза, липоматоза и амилоидоза с данными литературы было затруднено, кроме того, не удалось выявить различий в распространенности этих процессов в миокарде УПП и УЛП при разных формах ФП. В то время как результаты других авторов свидетельствовали о достоверно более выраженном фиброзе миокарда УПП [16, 20] и увеличении объемной фракции коллагена I и III типов [21] в миокарде УПП по сравнению с УЛП у пациентов с ФП, но большей распространенности амилоидоза в миокарде ЛП по сравнению с правым предсердием при ФП [12].
Характерным признаком преобразования структуры КМЦ предсердий при ФП стала частичная утрата миофибрилл в миоцитах (миолиз). В некоторых миоцитах зоны без миофибрилл могли занимать почти всю саркоплазму, остатки сократительного материала располагались под сарколеммой, в то время как оставшаяся часть саркоплазмы была заполнена многочисленными митохондриями, гранулами гликогена, цистернами ШЭР, трубочками саркоплазматического ретикулума (рис. 5, а—в). КМЦ, в которых зоны миолиза занимали до половины и более саркоплазмы регистрировали в УЛП у 27,3—55,6% пациентов с ФП и в УПП у 40—50% пациентов с ФП и у 37,5% пациентов с СР (см. табл. 2). Кроме того, при морфометрическом исследовании продемонстрирована вариабельность размера КМЦ обоих предсердий (см. табл. 2), диаметр некоторых КМЦ превышал 15 мкм и тогда КМЦ считались гипертрофированными. Так, диаметр кардиомиоцитов УПП у пациентов с ФП составлял в среднем 15,4—16 мкм и достоверно превышал диаметр КМЦ группы сравнения (12,6±2,3 мкм). В то время как диаметр КМЦ УЛП составлял в среднем 14,9—16,1 мкм и не отличался от такового в группе сравнения (15,7±2,8 мкм) (см. табл. 2). Очевидно, у пациентов с ФП, так же как у пациентов группы сравнения с патологией аорты и аортального клапана, КМЦ УЛП работали в режиме гемодинамической перегрузки и были гипертрофированы. Подобное увеличение размера КМЦ описано в миокарде у пациентов с ФП в сочетании с пороком митрального клапана и без патологии митрального клапана [1, 3, 4, 6, 7, 15, 16]. Следует отметить, что приведенные размеры предсердных КМЦ при ФП (см. табл. 2) не превышали представленные в литературе размеры КМЦ правого предсердия — 17,3±0,6 мкм [1], 19±4 мкм [5] и КМЦ ЛП — 18,6±1,5 мкм [6], 20±5 мкм [5] и 24,5±5 мкм [16] у пациентов с Ф.П. По нашим данным, во всех группах с ФП увеличение диаметра КМЦ УПП коррелировало с увеличением длины этих клеток (p<0,05; см. табл. 3). Также отмечено достоверное увеличение длины КМЦ УЛП в группе с ДПФП по сравнению с ПФП (p<0,05; см. табл. 2). Такой тип гипертрофии КМЦ с преимущественным увеличением их длины (в среднем до 70—130 мкм) ранее был описан в миокарде у пациентов с ФП в сочетании с митральной недостаточностью [15] и обсуждался как фактор развития дилатации ЛП, характерной для миокарда предсердий при ФП.
Сравнительный анализ морфологических изменений в миокарде предсердий у пациентов трех групп с ФП не выявил достоверных различий в распространенности интерстициального фиброза, липоматоза, изолированного амилоидоза предсердий, гипертрофии КМЦ и содержании в них миофибрилл. В каждой из групп с ФП регистрировали весь спектр изменений этих морфологических параметров, и только сопоставление клинико-морфологических корреляций у пациентов с разными формами ФП обнаружило различия в характере структурного ремоделирования миокарда предсердий. У пациентов с ПФП зоны миолиза преимущественно наблюдали в КМЦ УЛП небольшого диаметра, у пациентов с прогрессирующей дилатацией ЛП, регургитацией на митральном клапане и меньшей продолжительностью ФП в анамнезе; увеличение размера левого предсердия обратно коррелировало с диаметром КМЦ. Кроме того, КМЦ с зонами без миофибрилл реже регистрировали у пациентов с изолированным амилоидозом предсердий (p<0,05; см. табл. 3, рис. 6, а). У пациентов с ПРФП не выявлено взаимосвязи содержания миофибрилл, диаметра предсердных КМЦ и размера ЛП, однако обнаружены корреляции, характерные как для пациентов с ПФП (обратная корреляции между диаметром КМЦ и липоматозом УПП; утратой миофибрилл в КМЦ УЛП и длительностью ФП в анамнезе), так и для пациентов с ДПФП (например, обратная связь между изолированным амилоидозом предсердий и фиброзом миокарда УЛП (p<0,05; см. табл. 3, рис. 6, б). У пациентов с ДПФП в отличие от пациентов с ПФП увеличение диаметра КМЦ УЛП положительно коррелировало с увеличением размера ЛП, дилатацией фиброзного кольца митрального клапана, увеличением доли интерстициального фиброза в УЛП и выраженностью изолированного амилоидоза предсердий. Подобная взаимосвязь гипертрофии КМЦ с выраженностью фиброза описана в миокарде УЛП у пациентов с хронической ФП [3]. Кроме того, у пациентов с ДПФП с большей продолжительностью ФП в анамнезе отмечен рост длины КМЦ УЛП. В УПП увеличение диаметра КМЦ коррелировало с дилатацией фиброзного кольца трехстворчатого клапана и сопровождалось утратой в них миофибрилл, причем этот процесс был наиболее выражен в миокарде пациентов с изолированным амилоидозом предсердий (p<0,05; см. табл. 3, рис. 6, в).
Заключение
У пациентов всех групп с ФП (ПФП, ПРФП, ДПФП) обнаружены признаки структурного ремоделирования миокарда предсердий: фиброз, липоматоз, изолированный амилоидоз предсердий, гипертрофия КМЦ с явлениями частичной утраты миофибрилл. Корреляционный анализ клинических и морфологических параметров выявил достоверные различия в этих группах. У пациентов с ПФП перестройка миокарда сопровождалась гипертрофией части КМЦ с увеличением в них массы миофибрилл, увеличение размера КМЦ УЛП предотвращало дилатацию ЛП по аналогии с «компенсаторной гипертрофией» желудочковых КМЦ. При ПФП выраженность амилоидоза отрицательно коррелировала с утратой миофибрилл, которую регистрировали в мелких КМЦ, степень миолиза КМЦ положительно коррелировала с недостаточностью митрального клапана и дилатацией ЛП. У пациентов с ПРФП не обнаружены корреляции между размером КМЦ и содержанием в них миофибрилл, однако выявлены немногочисленные корреляции, характерные для пациентов как с ПФП, так и с ДПФП. В противоположность клинико-морфологическим изменениям, характерным для ПФП, при ДПФП отмечено увеличение диаметра КМЦ, которое коррелировало с дилатацией ЛП и фиброзного кольца митрального клапана. Феномен утраты миофибрилл отмечен в наиболее гипертрофированных КМЦ. Подобное ремоделирование КМЦ предсердий с уменьшением массы миофибрилл, вызванное их перегрузкой при ДПФП, напоминало процессы, происходящие в гипертрофированном миокарде желудочков на стадии «декомпенсации». Выраженность изолированного амилоидоза предсердий у пациентов с ДПФП положительно коррелировала с утратой миофибрилл в КМЦ.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: А.Ш.Р., Р.А.С., Т.В.С., В.А.В.
Сбор и обработка материала: А.Ш.Р., В.А.В., Т.В.С.
Статистическая обработка: Т.В.С.
Написание текста: Т.В.С.
Редактирование: Р.А.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.