Состояние иммунной системы - один из факторов, определяющих динамику злокачественного процесса [1]. Исследования последних лет показали, что клетки иммунной системы являются частью микроокружения опухоли и играют определяющую, но в то же время неоднозначную роль в прогрессировании опухолевого процесса и выживаемости онкологических больных [1-4].

Меланома кожи (МК) - злокачественная опухоль, с характерными гистологическими особенностями, одной из которых является лимфоцитарная инфильтрация (ЛИО) [5]. Лимфоциты, инфильтрирующие первичную меланому кожи (ПМК), отличаются иммунофенотипическими особенностями и разнонаправленностью воздействия на опухоль. Так, CD8 Т-лимфоциты оказывают цитотоксическое воздействие на опухолевые клетки, тогда как регуляторные Т-лимфоциты, экспрессирующие FoxP3, подавляют функции CD8 Т-лимфоцитов, способствуя ускользанию опухоли из-под иммунологического контроля [6, 7].

Изучение соотношения этих двух субпопуляций лимфоцитов в опухолевой ткани при аденокарциноме желудка, колоректальном, гепатоцеллюлярном раке, плоскоклеточном раке кожи (ПРК) дало неоднозначные результаты [8-11]. У больных колоректальным раком высокий индекс соотношения CD8⁺/Foxp3⁺ Т-лимфоцитов в ткани опухоли показал положительную корреляцию с отдаленной безрецидивной выживаемостью [8]. В то же время при аденокарциноме желудка и гепатоцеллюлярном раке высокое соотношение CD8⁺/Foxp3⁺ Т-лимфоцитов в опухолевой ткани являлось независимым негативным прогностическим фактором в отношении общей и безрецидивной выживаемости больных [9, 10]. Высокий индекс соотношения CD8⁺/Foxp3⁺ Т-лимфоцитов в ПРК имел положительную корреляцию со степенью дифференцировки опухоли [11]. При исследовании лимфоцитов, инфильтрирующих ПМК, с помощью мультиспектрального иммунофлюоресцентного анализа 36 случаев МК выявлено, что высокое соотношение CD8⁺/Foxp3⁺ Т-лимфоцитов является статистически достоверным фактором благоприятного прогноза течения заболевания [12]. Таким образом, изучение соотношения субпопуляций CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов в инфильтрате ПМК имеет актуальное значение и требует дополнительных исследований.

Цель настоящей работы - изучение корреляции индекса соотношения субпопуляций CD8/Foxp3 Т-лимфоцитов, инфильтрирующих ПМК, с основными клинико-морфологическими факторами прогноза течения заболевания.

Исследование выполнено на гистологическом материале, полученном от 180 больных с диагнозом МК, оперированных в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России за период 2003-2007 гг. Диагноз М.К. подтвержден данными гистологического исследования препаратов, по которым также оценивалась общая ЛИО в перитуморальной зоне. Иммуногистохимическое исследование выполняли на серийных депарафинизированных срезах опухолевой ткани с помощью биотин-стрептавидинового иммунопероксидазного метода с FoxP3 и CD8 моноклональными антителами (табл. 1).

Срезы толщиной 3-5 мкм депарафинизировали и регидратировали по стандартной схеме. Для демаскировки антигенов проводили предварительную обработку депарафинизированных срезов на водяной бане при температуре 95 °C в течение 40 мин с использованием цитратного буфера, рН 6,0 («Dako»). Срезы инкубировали с первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. В качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса использовали стандартный набор реагентов LSAB+ Kit или систему детекции SuperSensitive Polymer-HRP («BioGenex»). Для визуализации реакции применялся раствор диаминобензидина DAB+ («Dako»). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера (рисунок).

Оценку ЛИО ПМК проводили гистологически путем подсчета положительно окрашенных лимфоцитов в 10 полях зрения (×40). Вычисляли среднее количество положительно окрашенных клеток в 1 поле зрения и соотношение CD8/FoxP3 положительно окрашенных клеток путем деления их средних значений.

Статистическую обработку материалов проводили с использованием программ Microsoft Excel, Statistica software release 8.0 («Stat Soft Inc.»), за величину уровня статистической значимости принимали р<0,05.

В зависимости от значения индекса соотношения CD8/FoxP3 положительно окрашенных клеток все больные были разделены на 4 группы (табл. 2).

У больных ПМК наиболее часто индекс CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов был более 3 (42,2%), наименее часто - от 1 до 1,5 (14,4%). Также отмечалась тенденция к увеличению количества больных в группах наблюдения с увеличением индекса соотношения CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов.

Сравнительная клинико-морфологическая характеристика больных, распределенных по четырем группам, представлена в табл. 3.

Если в 1-й группе наблюдения преобладали больные мужского пола (62% случаев), то при увеличении индекса соотношения CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов возникает тенденция к равному распределению больных по полу во 2-й и 3-й группах с последующим преобладанием женщин в 4-й группе (60,5% случаев). В то же время распределение больных по полу не имело статистической значимости (р=0,22).

Получены статистически значимые различия между группами по стадиям заболевания. Больные в I стадии заболевания отсутствовали в 1-й группе, а во 2, 3 и 4-й группах отмечалась тенденция к увеличению их количества с увеличением индекса соотношения CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов (5,9, 9,0, 31,6% соответственно). При этом во всех группах больные во II стадии заболевания составили более 50% случаев.

По таким морфологическим признакам, как толщина опухоли по Бреслоу и тип роста опухоли, достоверных статистических различий между группами наблюдения выявлено не было. В то же время такие особенности опухоли, как наличие изъязвления, участков регрессии, количество митозов в 1 мм², показали статистически значимые различия между группами (р=0,001-0,002). Количество случаев изъязвления ПМК имело тенденцию к понижению с увеличением индекса соотношения CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов. Так, в 1-й группе изъязвление первичной опухоли отмечалось в 92,3% случаев, тогда как в 4-й группе - в 55,2% случаях. Наличие участков регрессии первичной опухоли в 1-й и 2-й группах составили более 30%, тогда как в 3-й и 4-й группах - не более 5%. Случаи, когда митозы в ПМК отсутствовали, не зафиксированы в 1-й группе. Во 2-й и 3-й группах было 5,9 и 4,5% случаев отсутствия митозов соответственно, в то же время в 4-й группе их зафиксировано в 5 раз больше (31,6%). Таким образом, отмечалась положительная корреляция количества случаев отсутствия митозов с увеличением индекса соотношения CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов. В остальном распределение случаев меланомы по количеству митозов во всех группах было примерно одинаковым.

Прогрессирование опухолевого процесса отмечено в 120 (66,7%) случаях. При этом только местный рецидив МК выявлен в 16 (13,3%) случаях, только метастазы в регионарных лимфатических узлах - в 26 (21,7%) случаях, только отдаленные метастазы - в 6 (5%) случаях. Синхронный или метахронный местный рецидив и метастазы в регионарных лимфатических узлах установлены в 10 (8,3%) случаях, метастазы в регионарных лимфатических узлах и отдаленные метастазы - в 40 (33,3%) случаях, местный рецидив с метастазами в лимфатических узлах и отдаленными метастазами - в 22 (18,3%) случаях, случаи сочетания местного рецидива с отдаленными метастазами не наблюдались, летальный исход зафиксирован в 74 (41,1%) случаях. Анализ частоты локальных рецидивов, метастазов в регионарных лимфатических узлах и отдаленных метастазов, представленный в табл. 4, показал некоторую закономерность.

Из табл. 4 следует, что между группами имелись статистически достоверные различия в течении заболевания. Частота локальных рецидивов заболевания в 1, 2 и 3-й группах была статистически значимо выше, чем в 4-й группе (р=0,03). Частота метастазов в регионарных лимфатических узлах в 1, 2 и 3-й группах также была статистически значимо выше, чем в 4-й группе (р=0,003). Частота отдаленных метастазов в 4-й группе была статистически значимо ниже, чем в остальных группах (р=0,0008).

Медиана длительности наблюдения за больными составила 111 мес (от 64 до 124) (табл. 5).

Время без прогрессирования и продолжительность жизни оказались максимальными в 4-й группе: 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость составили 76 и 58% соответственно. В других группах отдаленные результаты были значительно хуже. Наихудшие показатели зарегистрированы в 1-й группе: 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость составила 39 и 8% соответственно. Различия между группами статистически значимы и по времени без прогрессирования (р=0,03) и по продолжительности жизни (р=0,04).

В нашем исследовании получены статистически достоверные различия в 4 группах по стадии заболевания, наличию изъязвления, участков регрессии, количеству митозов в первичной опухоли. Частота метастазов в регионарных лимфатических узлах в группах с низким соотношением CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов (1-я и 2-я группа) статистически значимо выше, чем в группах с высоким соотношением CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов (3-я и 4-я группа) (р=0,003). Частота отдаленных метастазов в 4-й группе статистически значимо ниже, чем в остальных группах (р=0,00008).

Большинство данных литературы свидетельствует о том, что высокое соотношение CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов в опухолевой ткани является положительным прогностическим маркером течения онкологического заболевания [8-12].

В нашем исследовании преобладание CD8 Т-лимфоцитов над FoxP3 T-лимфоцитами более чем в 3 раза коррелировало с благоприятным прогнозом течения заболевания и высокой выживаемостью больных с МК, что согласуется с данными Z. Feng и соавт. [12], проводивших исследование 36 случаев ПМК.

Пятилетняя общая и безрецидивная выживаемость были максимальными в 4-й группе (76 и 58% соответственно), т. е. при достаточно выраженной инфильтрации опухоли CD8⁺-цитотоксическими лимфоцитами. Минимальные значения этих показателей зарегистрированы в 1-й группе (39 и 8% соответственно; р<0,03-0,04).

Таким образом, можно предположить, что соотношение инфильтрирующих первичную МК CD8/FoxP3 Т-лимфоцитов определяет уровень локального иммунного ответа организма, необходимого для сдерживания прогрессирования злокачественного процесса и лучшей выживаемости больных.

Комплексный подход к изучению субпопуляций иммунных клеток в микроокружении опухоли, нередко обладающих прямо противоположным действием на опухолевые клетки, помогает получить более полную картину межклеточного взаимодействия и спрогнозировать течение и исход заболевания.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Я.А.Б., Л.В.Д., Я.В.В., Н.В.К.

Сбор и обработка материала: Я.А.Б.

Статистическая обработка данных: И.А.П., Я.А.Б.

Написание текста: Я.А.Б.

Редактирование: Я.В.В., Л.В.Д.

Конфликт интересов отсутствует.