Меланомы с преобладающей веретеноклеточной морфологией сравнительно редки и представляют собой гетерогенный клинико-морфологический спектр злокачественных опухолей с меланоцитарной дифференцировкой. Доминирующая веретеноклеточность может быть особенностью ряда нозологических подвариантов меланомы, таких как поверхностно распространяющаяся, нодулярная, лентигинозная, а также диагностическим признаком других, в частности десмопластических форм. Кроме этого, в литературе описаны так называемые «веретеноклеточные меланомы», которые одни авторы рассматривают в качестве отдельной нозологии, что создает определенную понятийную путаницу [1], а другие исследователи используют данный термин лишь как описательный [2].

Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование иммуногистохимического профиля спектра веретеноклеточных меланом на предмет его однородности и анализ мутаций в генах BRAF и NRAS.

Для поиска веретеноклеточных меланом были пересмотрены меланомы и веретеноклеточные опухоли кожи архива НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова за 1982—2014 гг. и Санкт-Петербургского клинического научно-практического (онкологического) центра за 2012—2014 гг. Критериями отбора были дермальная/эпидермодермальная пролиферация атипичных веретеновидных клеток (не менее 80%) и доказательство меланоцитарной дифференцировки (наличие типичной интраэпидермальной меланоцитарной опухоли и/или иммуногистохимические маркеры меланоцитарного генеза). Было выявлено 58 случаев, строго отвечающих вышеуказанным критериям. В каждой опухоли были оценены следующие признаки: силуэт опухоли, симметричность, гистологическая архитектура, наличие юнкционального компонента, изъязвление эпидермиса, наличие пигмента, уровень инвазии по Кларку, толщина по Бреслоу, размер клеток и ядер, особенности их формы, выраженность атипии, митотическая активность с учетом феномена созревания, тип, выраженность коллагенизации стромы, ее качественный состав, наличие воспалительного инфильтрата, его качественный состав и внутриопухолевое распределение, наличие периневральной и васкулярной инвазии, а также сопутствующие изменения эпидермиса и дермы.

Для выяснения катамнеза были проанализированы истории болезни, медицинские карты наблюдения пациентов и данные телефонного опроса пациентов и/или родственников.

По результатам клинико-морфологического анализа с учетом отдаленных результатов спектр веретеноклеточных меланом был разделен на 6 групп:

А — нодулярные веретеноклеточные (полиповидное образование, как правило, пигментированное, с преобладающей фазой «вертикального» роста, компактной узловой пролиферацией опухолевых клеток и минимальным вовлечением эпидермиса; в 30% — метастазы в регионарных лимфатических узлах, безрецидивная выживаемость — 33 мес) (рис. 1, а);

Б — поверхностно распространяющиеся веретеноклеточные (пигментированное пятно или плоская бляшка с четкими контурами, гистологически выраженная «радиальная» фаза роста; в 14% — метастазы в регионарных лимфатических узлах, безрецидивная выживаемость — 120 мес) (см. рис. 1, б);

В — комбинированные (макроскопически сходные с нодулярной либо поверхностно распространяющейся меланомой, но микроскопически сочетающие один из вышеуказанных вариантов с десмопластической формой; в 50% — метастазы в регионарных лимфатических узлах, безрецидивная выживаемость — 12 мес) (см. рис. 1, в);

Г — саркоматоидные (плоская бляшка светло-серого или белесоватого цвета, без четких контуров с окружающими тканями, диффузно-компактная дермальная пучковая веретеноклеточная пролиферация с межпучковым типом коллагенизации, отчетливо визуализируемым при окраске по Массону; в 25% — местный рецидив, безрецидивная выживаемость — 18 мес) (см. рис. 1, г);

Д — смешанные десмопластические (беспигментное уплотнение кожи или плоская плохо очерченная бляшка, микроскопически сочетание десмопластической формы с участками саркоматоидной и/или эпителиоидноклеточной популяции; в 43% — местные рецидивы, безрецидивная выживаемость — 9,3 мес) (см. рис. 1, д);

Е — чистые десмопластические (беспигментное уплотнение кожи, напоминающее рубец, при гистологическом исследовании гипоклеточная диффузно-инфильтративная дермально-субдермальная пролиферация с межклеточным типом коллагенизации, составляющая 90% и более; в 75% — местные рецидивы, безрецидивная выживаемость — 8,6 мес) (см. рис. 1, е).

Морфологический анализ проводился по микропрепаратам, окрашенным гематоксилином и эозином, трихромом по Массону, по Вейгерту на эластические волокна, ШИК-реактивом, импрегнированных серебром для визуализации ретикулиновых волокон. Иммуногистохимическое исследование выполнено на автостейнере Ventana BM XT с использованием следующих антител: S100 («Genemed», Poly, 1:200), MelanA («Genemed», A103, 1:100), Melanosome («Genemed», HMB45, 1:100), Melanoma associated antigen («Ventana», PNL2, RTU), Melanoma associated antigen («Ventana», KBA.62, RTU), SOX10 («Cell Marque», Poly, 1:50), SMA («Cell Marque», 1A4, 1:200), CyclinD1 («Cell Marque», SP4, RTU), EMA («Cell Marque», E29, 1:100), Claudin1 («BOX Spring», Poly, 1:100), MITF («Cell Marque», C5/D5, 1:300), Collagen IV («DCS Innovative Diagnostic System», CIV22, 1:100), BRAF («BOX Spring», VE1, 1:100), c-Kit («Genemed», CD117, 1:100), DOG1 («Ventana», SP31, RTU), Nestin («Cell Marque», 10C2, 1:100). Количество опухолевых клеток, экспрессирующих антиген, оценивали полуколичественно: 0 — нет окрашивания, 1+ — окрашивание <5% клеток, 2+ — окрашивание 5—25% опухолевых клеток, 3+ — окрашивание 26—50% клеток, 4+ — окрашивание >50% клеток.

Участки парафиновых срезов опухоли выделялись для молекулярно-генетического анализа генов BRAF и NRAS, проводимого посредством ПЦР и секвенирования ДНК.

В нашем исследовании все опухоли исследуемого спектра экспрессировали S100, SOX10, KBA.62 и нестин, что указывало на общность их генеза и подтверждало меланоцитарную дифференцировку. Была отмечена диффузная и выраженная коэкспрессия SOX10 (рис. 2, а), S100 и нестина. В большинстве исследованных случаев окрашивание KBA.62 выявлялось в 50% и более опухолевых клеток (см. рис. 2, б), за исключением 1 десмопластической меланомы, где экспрессия составила менее 5%, и 1 нодулярной с умеренно выраженной реакцией с 26—50% опухоли.

Белки S100 и SOX10 являются также пан-шванновскими маркерами. Белок SOX10, кодируемый геном SOX10, локализующийся на 22-й хромосоме (22q13.1) и являющийся транскрипционным фактором, играет важную роль в формировании тканей и органов в процессе эмбриогенеза, особенно структур нервного гребня, периферической нервной и меланоцитарной системы, а также в поддержании уже дифференцированных клеток. Его роль в данном процессе делает этот транскрипционный фактор идеальным маркером шванновской и меланоцитарной дифференцировки клеток на различных стадиях их созревания. Исследованиями последних лет показано, что SOX10 является более специфичным и чувствительным маркером меланоцитарной и шванновской дифференцировки по сравнению с S100 [3]. KBA.62 — моноклональное антитело к антигенам, ассоциированным с меланомой, полученное с помощью специфической линии меланомных клеток. По данным разных авторов, иммунореактивность этого антитела составляет от 93 до 86% в различных вариантах злокачественной меланомы, в том числе 82% в десмопластическом типе [4, 5].

Белок нестин является одним из промежуточных филаментов и считается маркером нейроэктодермальных стволовых клеток, так как значительно экспрессируется в пролиферирующих клетках во время эмбрионального развития центральной нервной системы. В работе S. Brychtova и соавт. [6] экспрессия нестина была выявлена в доброкачественных меланоцитарных образованиях и в 84% первичных меланом. Причем увеличение количества нестин-позитивных клеток наблюдалось в поздних стадиях развития опухоли и соотносилось с более агрессивным течением заболевания. Результаты нашего исследования продемонстрировали выраженную экспрессию нестина в HMB45-негативных опухолях, отнесенных к смешанному и чистому десмопластическому варианту, что совпадает с данными работы M. Kanoh и соавт.[7], считающими нестин одним из основных диагностических маркеров НМВ45-отрицательных меланом. В нашей серии HMB45-позитивные опухоли также экспрессировали нестин, что противоречит данным M. Kanoh.

Неоднородность спектра на иммуногистохимическом уровне подчеркивала иммунореактивность с MelanA, HMB45 и PNL2, коррелировавших друг с другом. Если в группах веретеновидных меланом, классифицированных как поверхностно распространяющаяся и нодулярная, реакция с этими антителами была выраженная и составляла 50% и более, то в десмопластическом типе она отсутствовала (см. рис. 2, в). Эти результаты совпадают с данными других авторов [8]. При этом в группе, обозначенной нами как саркоматоидные и занявшей промежуточную позицию спектра, диффузно визуализировались отдельные клетки, экспрессировавшие вышеуказанные маркеры. Вероятно, это явление отражает различные уровни меланоцитарной дифференцировки клеток (табл. 1).

В нашей серии была выявлена выраженная диффузная экспрессия циклина Д1 во всех исследованных опухолях, в том числе в чистых, смешанных десмопластических меланомах и так называемых саркоматоидных (см. рис. 2, г). Циклин Д1 играет важную роль в процессах клеточной пролиферации, в прогрессии от G1 к S-фазе и является онкогеном в меланомах [9]. Несмотря на уже общеизвестный факт об иммуногистохимической гиперэкспрессии этого маркера в большинстве меланом, мы не встретили работ, изучавших экспрессию циклина Д1 в десмопластических вариантах.

Среди меланом веретеноклеточного спектра нами было выявлено 36% CD117-позитивных случаев, при этом иммунореактивность с DOG1 отсутствовала. Экспрессия CD117 документирована в меланомах, преимущественно акральной локализации. Среди веретеноклеточных вариантов D. Miller и соавт. [10, 11] отметили существенную разницу между чистыми и смешанными десмопластическими меланомами. Они обнаружили 26% CD117-позитивных чистых десмопластических меланом и 78% позитивных смешанных, при этом не было строгой корреляции с наличием мутаций в гене c-kit (экзоны 11, 13 и 17). Данный факт авторы объясняют либо незрелостью белка, продукта данного гена, либо возможными мутациями других экзонов.

В настоящей серии меланом с веретеноклеточной морфологией мы не выявили популяции клеток с периневральной дифференцировкой (ЕМА и Сlaudin1 были негативные во всех исследованных случаях), которая иногда встречается в невусах [12].

Во всех группах, за исключением комбинированных меланом, отмечалась внутриопухолевая однородность иммунофенотипа. В группе комбинированных меланом обращала на себя внимание бифазность. Опухоли сочетали дифференцированные участки веретеноклеточной нодулярной или поверхностно распространяющейся меланомы с десмопластическим или саркоматоидным типом. При этом иммунофенотип их различался в пределах одной опухоли (см. рис. 2, в).

Интересной особенностью, отмеченной и в предыдущих работах, явилась диффузная иммуноэкспрессия SMA в меланомах десмопластического типа [13]. При этом двойное окрашивание с S100 показало, что гладкомышечный актин экспрессируется на S100-негативных миофибробластоподобных клетках, расположенных диффузно между S100-позитивными меланоцитарными, в свою очередь негативных к SMA (см. рис. 2, д). Мы обнаружили только одну работу, содержащую результаты аналогичного исследования [14]. Количество актин-позитивных клеток было взаимосвязано со степенью межклеточной коллагенизации и уменьшалось в более клеточных участках смешанных десмопластических и саркоматоидных разновидностей, где носило межпучковый характер. Эти клетки отсутствовали в веретеноклеточных нодулярных и поверхностно распространяющихся меланомах, а также в соответствующей части комбинированных форм.

Проведенный анализ генов BRAF и NRAS, являющихся наиболее частыми в меланомах, обнаружил наличие мутаций в гене BRAF в 23% веретеноклеточных меланом, что полностью коррелировало с иммуноэкспрессией BRAF (см. рис. 2, е; рис. 3). Мутации в гене NRAS были выявлены в 8% случаев. При этом меланомы десмопластического типа не несли вышеуказанных мутаций (табл. 2), что совпадает с результатами других исследователей [15, 16].

Полученные результаты указывают на вариантную гетерогенность спектра меланом, объединенных морфологическим феноменом веретеноклеточности, что подтверждается как на клинико-морфологическом, так и на иммуногистохимическом и молекулярно-генетическом уровнях.

Нюансы иммунофенотипа и генетические особенности веретеноклеточных меланом могут быть использованы для корректной диагностики и выбора оптимальной лечебной тактики.

Участие авторов:

Концепция и дизайн: К.В.Ш., Е.Н.И.

Сбор и обработка материала: В.А.Х., А.Г.И.

Статистическая обработка данных: В.А.Х., А.Г.И.

Написание текста: К.В.Ш., В.А.Х.

Редактирование: К.В.Ш.

Конфликт интересов отсутствует.