В современных международных гистологических классификациях для оценки злокачественного потенциала многих опухолей разработан комплекс прогностических критериев, обычно включающий и количественные показатели клеточной пролиферации. Известно, что темпы роста карциномы определяются прежде всего митотической активностью и выраженностью апоптоза опухолевых клеток, для оценки которых используют индекс пролиферации по Ki-67 (индекс Ki-67), митотический и апоптотический индексы (МИ и АИ соответственно).

Прогностическая значимость МИ и АИ при опухолевом росте проверена на большом числе наблюдений [1]. Вместе с тем подобные исследования, выполненные при раке желудка (РЖ), малочисленны и фрагментарны [2-4]. В частности, T. Shinohara и соавт. [5] установили, что степень дифференцировки карциномы желудка имеет прямую корреляцию с величиной АИ и обратную - с показателями индекса Ki-67, при этом соотношение указанных индексов в более дифференцированных карциномах выше, чем в низкодифференцированных.

D. Jesionek-Kupnicka и соавт. [6] не обнаружили связи между величиной АИ, гистологическим типом РЖ, частотой метастазирования и интенсивностью неоваскуляризации опухоли. L. Saragoni и соавт. [3] также не выявили влияния величины АИ на прогноз РЖ, однако Y. Jia и соавт. [7] установили, что более высокие значения этого показателя коррелируют с лучшей выживаемостью.

В большинстве исследований, как отечественных, так и зарубежных, выполненных на биопсийном и операционном материале, потенциал злокачественности опухоли, как правило, оценивается только по одному из перечисленных показателей клеточного обновления, чаще всего по числу митозов на определенное количество (от 10 до 50) репрезентативных полей зрения, при этом количество клеток в одном поле не учитывается, хотя их размеры могут значительной варьировать. Совершенно очевидно, что при таком подходе трудно рассчитывать на получение объективной информации о темпах прогрессирования опухоли и использовать эти данные в алгоритме построения прогноза у онкологических больных.

Цель исследования - комплексная оценка темпов клеточного обновления - пролиферативной активности и выраженности апоптоза опухолевых клеток с вычислением индекса Ki-67, МИ и АИ в карциномах желудка в зависимости от гистологического варианта и функционального иммунофенотипа (ИФТ) опухоли, а также определение возможной связи перечисленных показателей с послеоперационной 4-летней скорректированной безрецидивной выживаемостью.

Исследование проведено на операционном материале 55 карцином желудка с подразделением наблюдений на гистологические варианты в соответствии с Международной гистологической классификацией (ВОЗ, 2010) и на функциональный ИФТ в зависимости от набора продуцируемых муцинов [8]. Подсчет митозов и апоптотических телец проводили при иммерсионном увеличении микроскопа в гистологических срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином. МИ и АИ выражали в промилле, т.е. на 1000 учтенных опухолевых клеток. Вычисляли показатель, условно названный нами «коэффициент клеточного обновления» (ККО):

ККО=МИ·АИ.

Иммуногистохимическое исследование проводили пероксидазно-антипероксидазным методом на парафиновых срезах толщиной 5 мкм по стандартному протоколу с применением моноклональных антител к Ki-67 («DAKO», MIB1, 1:75). Инкубацию с первичными антителами проводили после предварительной обработки срезов в микроволновом режиме (дважды по 5 мин при мощности 650 Вт с интервалом в 2 мин). На следующих этапах применяли KIT («Envision», «Mouse/Rabbit») и хромоген диаминобензидин (DAB) фирмы «DAKO», ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.

Индекс Ki-67 вычисляли по количеству ядер, иммунопозитивных к белку Ki-67 на 1000 учтенных опухолевых клеток при ув. 1000, но так как значения индекса в промилле получались слишком большими, его для удобства выражали в процентах.

Ранее нами был проведен анализ результатов радикального хирургического лечения 55 пациентов с РЖ в зависимости от гистологического варианта и типа функциональной дифференцировки опухоли по набору продуцируемых муцинов (карциномы с желудочным, кишечным и смешанным ИФТ). РЖ с кишечным ИФТ не был включен в статистическую разработку из-за малочисленности группы. Анализ 4-летней скорректированной безрецидивной выживаемости по методу Каплана-Мейера выявил достоверные различия показателей выживаемости при указанных ИФТ-вариантах РЖ: 26% при желудочном ИФТ и всего 12% при смешанном ИФТ [9].

Установлено, что МИ в РЖ варьировал от 11 до 54‰ (рис. 1),

Показатели МИ, АИ и индекса Ki-67 были сгруппированы в зависимости от локализации, гистологической стадии, гистологического варианта и функционального ИФТ карцином, однако достоверные различия обнаружены только в группах, различающихся по гистологическому типу и иммунофенотипическим особенностям (табл. 1).

Как следует из табл. 1, слизистой карциноме, папиллярным и тубулярным аденокарциномам (АК) низкой степени злокачественности (НСЗ) свойственны статистически значимо меньшие показатели индекса Ki-67 по сравнению со слабо когезивными, смешанными карциномами и тубулярными АК высокой степени злокачественности (ВСЗ; p<0,05). Наиболее низкие показатели индекса Ki-67 оказались у РЖ с кишечным ИФТ, промежуточные - со смешанным ИФТ, высокие - с желудочным ИФТ (p<0,05).

Статистически значимо более низкие показатели МИ свойственны слизистой, слабо когезивным карциномам и папиллярным АК по сравнению со смешанными карциномами, тубулярными АК НСЗ и ВСЗ (p<0,05). Для карцином с кишечным ИФТ установлен самый низкий МИ, со смешанным ИФТ - промежуточный, с желудочным ИФТ - самый высокий (p<0,05).

Достоверно меньшие показатели АИ установлены в слизистой, слабо когезивных, смешанных карциномах и АК ВСЗ по сравнению с папиллярными и тубулярными АК НСЗ (p<0,05). Самый низкий АИ обнаружен при РЖ со смешанным ИФТ, самый высокий - с желудочным ИФТ. В карциномах с кишечным ИФТ установлено промежуточное значение АИ (p<0,05).

В зависимости от величины индекса Ki-67, МИ и АИ все карциномы были условно разделены на опухоли с умеренными и повышенными показателями клеточного обновления. К 1-й группе отнесли карциномы, в которых индекс Ki-67 ≤20%, МИ ≤30‰, АИ ≤40‰, ко 2-й группе - карциномы, показатели которых были выше указанных значений.

Было установлено, что смешанные карциномы чаще характеризовались повышенными показателями, слабо когезивные карциномы - умеренными показателями индекса Ki-67, среди АК одинаково часто встретились опухоли 1-й и 2-й групп (p<0,05). Карциномы с желудочным ИФТ чаще имели повышенные показатели индекса Ki-67, со смешанным ИФТ - умеренные (p<0,05), а с кишечным ИФТ встретились в обеих группах, но из-за малочисленности они были исключены из статистического анализа.

Среди смешанных карцином преобладали опухоли с повышенным МИ, слабо когезивных карцином - с умеренным, среди АК случаи с повышенным и умеренным МИ встречались с одинаковой частотой (p<0,05). Карциномы с желудочным ИФТ чаще имели повышенную митотическую активность, со смешанным и кишечным ИФТ - умеренную (p<0,05).

Повышенный АИ был характерен для АК, умеренный - слабо когезивных и смешанных раков (p<0,05). Среди карцином с желудочным ИФТ чаще выявлялись случаи с повышенным АИ, со смешанным ИФТ - с умеренным АИ (p<0,05), с кишечным ИФТ встречались случаи как с повышенным, так и с умеренным АИ.

Таким образом, результаты нашего исследования в целом согласуются с данными немногочисленных публикаций, посвященных этой проблеме, в которых было установлено, что высокодифференцированным АК и смешанным карциномам свойственны более высокие значения индекса Ki-67 и МИ, чем низкодифференцированным (слабо когезивным карциномам по современной гистологической классификации) [10, 11].

Вычисление ККО показало, что в гистологических вариантах карцином ВСЗ этот показатель был больше 1, НСЗ - меньше 1.

При группировке карцином в зависимости от функционального ИФТ ККО больше 1 выявлен в карциномах со смешанным ИФТ, меньше 1 - с желудочным и кишечным ИФТ, причем в последних самый низкий. Различия величины ККО в карциномах смешанного и желудочного ИФТ оказались статистически значимыми (p<0,05).

Полученные результаты позволяют предположить, что темпы прироста массы опухолевых клеток достоверно выше в слабо когезивных и смешанных карциномах, чем в слизистом раке, папиллярных и тубулярных АК, а в карциномах со смешанным ИФТ выше, чем с желудочным ИФТ. Эти результаты частично согласуются с данными немногочисленных публикаций [11, 12], при этом сообщений об исследованиях АИ в различных ИФТ-вариантах РЖ мы не встретили.

Для объективизации оценки прогностической значимости индекса Ki-67, МИ и АИ при РЖ эти показатели были сгруппированы в зависимости от исхода заболевания у оперированных пациентов на момент мониторирования (табл. 2).

Оказалось, что у живых пациентов показатели МИ были достоверно ниже, а показатели АИ достоверно выше, чем у умерших, при этом величины индекса Ki-67 достоверно не различались, хотя у живых пациентов они были несколько ниже, чем у умерших. Наиболее значимые различия были обнаружены при сопоставлении величины ККО.

Ниже представлен анализ послеоперационной 4-летней безрецидивной выживаемости, проведенный по методу Каплана-Мейера (лог-ранговый критерий) среди пациентов, сгруппированных в зависимости от величины исследуемых показателей клеточного обновления (рис. 5-8).

Таким образом, выявлена статистически значимая зависимость послеоперационной выживаемости от МИ, АИ и ККО, при этом критериями неблагоприятного прогноза РЖ являются МИ >30‰, АИ ≤40‰ и ККО >0,7. Зависимости выживаемости от показателей индекса Ki-67 нами не обнаружено.

Традиционно индекс пролиферации по Ki-67 в качестве фактора прогноза предлагают использовать и для РЖ, расценивая высокие показатели экспрессии этого белка как неблагоприятный прогностический признак [13, 14]. Вместе с тем наше исследование показало, что в карциномах желудка прогностическая значимость этого маркера спорна. Мы согласны с выводами авторов [10, 15, 16], которые не обнаружили в карциномах этой локализации корреляции между высокими показателями экспрессии Ki-67 и неблагоприятным прогнозом, а в одном из исследований, проведенном H. Lee и соавт. [17], даже была выявлена обратная связь.

Таким образом, индекс Ki-67 в карциномах желудка не имеет прогностического значения, что, по всей вероятности, объясняется неадекватностью этого показателя для оценки биологического потенциала опухолей, развившихся в тканях с постоянно обновляющимися клеточными популяциями, что присуще эпителию слизистой оболочки желудка, особенно шеек желез, с которым гистогенетически связано большинство РЖ.

Сопоставление показателей с выживаемостью было проведено для МИ, АИ и ККО, при этом установлено, что в группе живых пациентов на момент мониторирования значения МИ и ККО были статистически значимо ниже, а АИ - достоверно выше, чем в группе умерших пациентов, что в целом согласуется с данными M. Staunton и соавт. [4].

Проведенное исследование установило, что величины МИ, АИ, индекса Ki-67 и так называемого «коэффициента клеточного обновления» в карциномах желудка достоверно связаны с гистологическим вариантом и функциональным иммунофенотипом опухоли, а МИ, АИ и «коэффициент клеточного обновления» - и с послеоперационной 4-летней скорректированной безрецидивной выживаемостью, что позволяет их рекомендовать в качестве дополнительных критериев прогноза у больных РЖ.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И.А.К., Л.Е.Г.

Сбор и обработка материала: Л.Е.Г.

Статистическая обработка данных: Л.Е.Г.

Написание текста: И.А.К., Л.Е.Г.

Редактирование: И.А.К.