Нарушение структуры тимуса и его функциональных свойств при различных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы может являться причиной развития акцидентальной инволюции органа, определяя дефектное состояние иммунной системы в целом. Нами изучены особенности раннего постнатального состояния тканей тимуса у детей с врожденными пороками сердца.

В патогенезе данного заболевания лежит механизм нарушения системной гемодинамики, ведущего к развитию тканевой гипоксии различных органов, в том числе тимуса.

В норме у новорожденного тимус уже полностью сформирован. На 1-й неделе после рождения из костного мозга в тимус мигрируют Т-клетки-предшественники с фенотипом CD3^-CD4^-CD8^- с последующей дифференцировкой их до зрелых лимфоцитов CD3⁺CD4⁺CD8^-, CD3⁺CD4^-CD8⁺ и, как результат, происходит пополнение циркулирующего пула Т-лимфоцитов [1—4]. В созревании тимоцитов на этапе антигеннезависимой дифференцировки ведущую роль играют тимусные эпителиальные клетки (ТЭК) [3—6]. Многие из них выполняют функцию тканевого каркаса и являются источниками сигналов для развивающихся тимоцитов, генерируемых при прямых контактах. ТЭК служат не только источником стимулов для дифференцировки тимоцитов, но и определяют выбор между пролиферацией и апоптозом этих клеток в процессе положительной и отрицательной селекции. Следствием таких взаимодействий является взаимная активация лимфоидных и эпителиальных клеток [1, 2, 4, 5, 7].

Цель работы — изучить морфологические и иммуногистохимические особенности строения тимуса у новорожденных детей с врожденными пороками сердца.

Тимус получали от детей в возрасте до 1 года, оперированных по поводу врожденного порока сердца, с одновременно проводимой тимэктомией в соответствии с существующей хирургической практикой в Федеральном краевом центре сердечно-сосудистой хирургии Перми.

В зависимости от сложности порока сердца, определяющего степень гипоксии, были выделены две группы детей: в 1-ю вошли 22 ребенка с синим (тяжелым) пороком, сопровождающимся право-левым сбросом крови и смешиванием артериальной и венозной крови (тетрада Фалло; аномалия Эбштейна; транспозиция магистральных сосудов); во 2-ю — 25 детей с белым или бледным пороком, имеющим лево-правый сброс крови без смешивания артериальной и венозной крови (дефект межжелудочковой или межпредсердной перегородки). Образцы материала фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,2). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Футу (на состояние ретикулярных волокон); тучные клетки выявляли по Шубичу. Для получения полутонких срезов кусочки тимуса размером 1—2 мм3 фиксировали в 10% растворе глутарового альдегида и 1% растворе OsO₄, дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в аралдитовые смолы. Готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым синим.

Для оценки иммуногистохимического состояния клеток проводили окраску мечеными моноклональными антителами: Bcl-2 (для определения клеток, устойчивых к апоптозу), Ki-67 (маркер ядер пролиферирующих клеток), виментином (выявляет клетки — производные мезенхимы), CD34 (определяет костномозговые предшественники). Для визуализации результатов использовали системы детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer. Препараты инкубировали с хромогеном DAV Plus Substrate System и докрашивали гематоксилином Майера с заключением в БиоМаунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого антигена («Labvision», США).

Компьютерную морфометрию проводили с помощью программы IMAG PRO⁺ 4.0 на морфометрической установке Олимпус. Данные подвергали статистической обработке. Достоверность различий определяли с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни, используя программу Statistica 7.0. Различия считали достоверными при p<0,05.

У детей с врожденным пороком сердца в тимусе имелись структурные изменения тканей, наиболее выраженные в 1-й группе. У них отмечались значительные расстройства кровообращения, сопровождающиеся расширением и переполнением сосудов кровью. В корковой части долек определялись мелкоочаговые кровоизлияния, что нередко наблюдается и при гипоксии другого генеза [8].

В большинстве крупных и мелких сосудов имелся застой клеток крови с признаками гемолиза эритроцитов и периваскулярным формированием грубых коллагеновых волокон. Последнее отмечалось как в корковом, так и в мозговом веществе долек. В междольковой соединительной ткани избыточно развивалась жировая ткань, представленная крупными и мелкими скоплениями виментин-позитивных адипоцитов. Соединительная ткань нередко врастала в дольки, частично замещая их функциональную часть. В таких участках формировался неровный край, чаще фестончатый. На полутонких срезах были заметны признаки дистрофических изменений клеток стромы, что приводило к нарушениям их связи с лимфоцитами («зоны отчуждения») и гнездному опустошению коры долек. На этом фоне активизировались клетки фибробластического дифферона с положительной экспрессией моноклональных антител CD34 и виментина, характерных для прогениторных клеток мезенхимального происхождения. В кортикальной зоне эти клетки формировали достаточно крупные скопления в виде групп или цепочек. В участках деструкции тканей тимуса в присутствии CD34 и виментин-позитивных клеток развивался активный ангиогенез (рис. 1).

У детей обеих групп в тканях тимуса одиночно или группами также выявлялись мастоциты. Тучные клетки имели разный размер, цитоплазма их была заполнена гранулами, часть клеток находились на стадии активной дегрануляции. В таких участках был резче выражен отек стромы и соединительнотканных структур. Находясь между лимфоцитами, тучные клетки в корковом веществе формировали мастолимфоцитарные розетки. Во внутридольковом периваскулярном пространстве кортико-медуллярной зоны также отмечались переполненные сосуды с явлением диапедеза эритроцитов. В подобных участках вдоль сосудов располагались крупные тучные клетки и фибробласты. Последние, по данным литературы [6, 9, 10], способны синтезировать ряд основных посредников воспаления, активизирующих тучные клетки.

В тимусе детей 2-й группы наблюдались аналогичные морфологические изменения, но выраженные в меньшей степени.

Структурные изменения тимуса сопровождались устойчивостью лимфоцитов к апоптозу, что влияло на их пролиферативные свойства. Признаком служила активность генов bcl-2 в клетках коркового вещества долек тимуса. Положительная экспрессия генов bcl-2 имелась в субкапсулярной и основной части коркового вещества дольки. Bcl-2-позитивные лимфоциты чаще выявлялись диффузно, нередко формируя скопления. При выраженных состояниях гипоксии (1-я группа) на фоне осложненного врожденного порока сердца экспрессия bcl-2 в цитоплазме клеток увеличивалась от субкапсулярной к кортико-медуллярной зоне. В субкапсулярной зоне у детей 1-й группы доля Bcl-2-позитивных лимфоцитов составляла 32,2±6,1%, 2-й группы — 41±3,8%. В кортикальной части дольки в участках дубль-позитивных лимфоцитов (CD4+CD8+) экспрессия Bcl-2 достаточно сильно выявлялась в диффузно расположенных лимфоцитах (18,6±2,9% в 1-й группе, 9,8±3% во 2-й группе). От мозгового вещества в сторону коры формировались крупные скопления Bcl-2-позитивных лимфоцитов (рис. 2).

Помимо появления в коре долек тимуса нетипичных апоптозоустойчивых лимфоцитов, находящихся на этапах кортикального созревания, имелось нарушение структуры гематотимического барьера в кортико-медуллярной зоне, что хорошо выявлялось при окрашивании срезов по Футу. Формирующиеся в результате этого обширные очаги повреждения барьера способствовали миграции лимфоцитов из мозговой части дольки в корковое вещество (рис. 3).

При изучении пролиферативной способности клеток положительная экспрессия Ki-67 выявлялась в диффузно расположенных лимфоцитах в пределах всей дольки тимуса (рис. 4).

При сравнении двух групп детей доля тимоцитов, экспрессирующих Ki-67, в обеих группах статистически не различалась и составила 51,0±2,2% в 1-й группе и 52,2±3,1% — во 2-й. Однако доля клеток, находящихся на стадии S-периода, во 2-й группе была на 63,3±5,8% выше, чем в 1-й. На наш взгляд, это обусловлено задержкой этапов дифференцировки лимфоцитов из-за выраженного процесса деструкции эпителиальных клеток стромы. Действительно, на полутонких срезах выявлялись значительные дистрофические изменения тимусного эпителия с явлениями апоптоза клеток. В этих участках накапливались активные макрофаги с многочисленными вакуолями, светлого или пенистого характера, и фагоцитированным материалом. Макрофаги поглощали погибшие клетки, частично сами разрушались из-за перегруженности фагоцитированным материалом и выхода лизосомальных ферментов (рис. 5).

ТЭК являются основным компонентом микроокружения тимоцитов. Взаимоотношения тимоцитов и ТЭК являются реципрокными. Обмениваясь сигналами, эти клетки поддерживают свои жизнеспособность, активность и структурную организацию [1, 3, 5, 7, 9, 11]. Морфологические изменения тимуса свидетельствовали о том, что деструкция и гибель ТЭК существенно влияют на пролиферацию лимфоцитов. Тимоциты без тканевого каркаса недополучают сигналы для своего развития, задерживается их пролиферация или они подвергаются апоптозу [1, 7, 11, 12]. На уровне субкапсулярной части тимоциты теряют контакты, прежде всего с эпителиальными клетками, секретирующими интерлейкин-7. Основная функция этого цитокина — поддержание выживаемости созревающих тимоцитов путем индукции экспрессии антиапоптического фактора Bcl-2 [5, 7, 11, 12]. Несостоятельность данной функции проявлялась у детей 1-й группы в тимусах, в которых доля Bcl-2-позитивных лимфоцитов была небольшая. Недавние костномозговые мигранты, становясь уязвимыми, частично подвергались апоптозу, не пройдя всех этапов своего развития. На уровне кортикальной зоны в норме тимоциты, экспрессирующие рецепторный комплекс CD3⁺CD4⁺CD8⁺, практически лишены Bcl-2, что обрекает их на гибель из-за отсутствия специализированных факторов защиты. Нарушение структуры ТЭК этой части коры дольки способствовало быстрому перемещению тимоцитов на границу кортико-медуллярной зоны, что не позволяло им завершить этапы дифференцировки. Очевидно, недостающий контакт лимфоцитов с ТЭК на этапах кортикального созревания вызывает нарушение селекционного отбора в условиях антигеннезависимой дифференцировки, что приводит к гибели тимоцитов.

Таким образом, у детей 1-й группы (по сравнению со 2-й) в тимусе при врожденной гипоксии формируется комплекс значительных морфологических изменений, влияющих на устойчивость лимфоцитов к апоптозу и нарушению их перераспределения в коре долек тимуса.

В отличие от патогенеза акцидентальной инволюции, проявляющейся снижением объема лимфоидной ткани органа на фоне сохранения структуры эпителиальной стромы и восстановления функции органа, при врожденной гипоксии, обусловленной врожденным пороком сердца, этого не происходит, и возврат к функциональному восстановлению маловероятен. Этот факт можно рассматривать как вариант врожденной патологической инволюции необратимого характера и проявляющийся заместительным цитогенезом клеток фибробластического дифферона, не способных в силу своих гистогенетических свойств создавать условия для развития Т-лимфоцитов на этапе их антигеннезависимой дифференцировки. Последствия в этом случае для всей иммунной системы очевидны.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №11-04-96023 p_урал_а).