Почечно-клеточный рак (ПКР) впервые описан Konig в 1826 г. Однако, несмотря на столь длительную историю изучения, остается много нерешенных вопросов. В последние десятилетия активно проводятся генетические исследования опухолей почки. Были обоснованы подходы к таргетной терапии, значительным изменениям подверглась классификация, в которой появились новые нозологические формы и исключены некоторые варианты опухолей. Это заставило ученых пересмотреть результаты 20-летних наблюдений [1]. В настоящее время исследователи изучают широкий спектр молекулярных маркеров, среди которых белки-регуляторы клеточного цикла, молекулы адгезии, клеточные ферменты, оценивается их влияние на поведение и прогноз ПКР. Задача осложняется относительно малым числом наблюдений несветлоклеточных форм ПКР, разнообразием их вариантов и типов строения.

Для опухолевых клеток характерно уменьшение или полная утрата адгезивных свойств, что ведет к дезорганизации тканевого пласта и хаотичности расположения отдельных гистологических структур. Белок CD44 (синонимы — Pgp-1, Ly-24, Hermes, рецептор хоуминга лимфоцитов, H-CAM, HUTCH-1) является неспецифической молекулой адгезии, представителем семейства трансмембранных гликопротеинов. Ген, кодирующий этот белок, содержит более 20 экзонов, в результате альтернативного сплайсинга экспрессируются многие его изоформы. Внеклеточный домен CD44 соединяется с гиалуроновой кислотой, остеопонином, фибронектином, коллагеном, ламинином, трансмембранный домен обеспечивает хоуминг лимфоцитов, внутриклеточный домен посредством белков анкирина или ERM-комплекса (ezrin—radixin—moesin) взаимодействует с актиновыми филаментами цитоскелета и обеспечивает передачу сигналов регуляции клеточного цикла. Повышение уровня экспрессии CD44 обеспечивает инвазивный потенциал опухоли [2, 3]. Первые работы по исследованию роли этого белка в патогенезе ПКР появились в 1995 г. [4]. H. Terpe и соавт. [5] отметили положительную корреляцию экспрессии CD44 и степени дифференцировки опухоли, в конце 1990-х годов была отмечена прогностическая значимость этого белка для некоторых вариантов ПКР [6, 7]. В настоящее время гиперэкспрессия CD44 — один из немногих широко признаваемых прогностических факторов неблагоприятного течения ПКР. По данным S. Kroeze и соавт. [8], экспрессия CD44 является независимым фактором прогноза светлоклеточного рака, а E. Yildiz и соавт. [9] считают, что уровень экспрессии CD44 в совокупности с маркером пролиферативной активности Ki-67 и эндотелиальным сосудистым фактором роста (VEGF) можно использовать для определения группы неблагоприятного прогноза. Несмотря на обнадеживающие результаты, CD44 не валидирован как прогностический признак ПКР [10].

Другим протеином, обеспечивающим адгезию клеток, является трансмембранный белок, эпителиальный мембранный антиген, EMA (синоним — MUC1, CD227). Он влияет на взаимодействие клеток и матрикса, участвует в трансдукции сигналов, в частности, связываясь с β-катенином своим внутриклеточным доменом, ослабляет E-cadherin-опосредованные межклеточные взаимодействия [11]. Гиперэкспрессия белка характерна для опухолей многих локализаций. Для почечно-клеточных карцином EMA длительное время применяется в качестве одного из маркеров диагностической панели. В начале 2000-х годов было выявлено, что высокий уровень экспрессии ЕМА характеризует преимущественно низкодифференцированные опухоли продвинутых стадий. При этом гиперэкспрессия белка с разной частотой определяется во всех гистологических формах ПКР [12]. Однако, по результатам разных авторов, прогностическая значимость ЕМА спорна. Так, А. Bamias и соавт. [13] опубликовали данные о влиянии уровня экспрессии ЕМА на прогноз ПКР, исследовав 92 опухоли, а группа ученых под руководством К. Denda-Nagai [14] на экспериментальной модели не получила значимых результатов. В 2009 г. S. Aubert и соавт. [15] на клеточной линии светлоклеточного ПКР показали, что EMA может быть мишенью для таргетной терапии.

Белок E-cadherin, обеспечивающий адгезивные свойства клеток, является важным регулятором клеточного цикла, участвуя в Wnt-пути, который регулирует межклеточные взаимодействия и пролиферативную активность клетки. Его прогностическая значимость доказана для опухолей многих локализаций [3], но для почечно-клеточных карцином остается спорной. По данным литературы, экспрессия E-cadherin характерна для всех вариантов ПКР, но наибольший ее уровень выявляется в хромофобных и светлоклеточных опухолях [16].

В настоящей работе представлены результаты исследования прогностической значимости экспрессии белков CD44, E-cadherin, EMA для несветлоклеточного ПКР. Исследование выполнено на операционном материале 105 больных, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А. Герцена с 1999 по 2010 г. Изучено 54 папиллярных карцином, 39 хромофобных и в качестве группы сравнения 12 случаев светлоклеточного рака.

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Срезы толщиной 4 мкм монтировали на высокоадгезивные предметные стекла (Polysine Slides, «Menzel GmbH&Co KG», Германия). Депарафинирование и предобработку проводили по стандартной методике с помощью системы EnVision Flex («Dako», Дания) в PT-модуле. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в автостейнере Autosteiner Line48 («Dako») срезы докрашивали гематоксилином. В каждой серии препаратов использовали соответствующие положительные и отрицательные контроли. Были использованы следующие антитела («Dako»): CD44 — клон DF1485, M7082, разведение 1:50; E-cadherin — клон NCH-38, IS059, разведение 1:70; EMA — клон E29, IS629, разведение 1:200. Результаты реакции оценивали полуколичественно, для каждого белка был установлен уровень гиперэкспрессии: для CD44 и ЕМА — интенсивное окрашивание более 40% клеток опухоли или умеренное — более 60% клеток; для E-cadherin — интенсивное окрашивание более 30% клеток опухоли или умеренное — более 50% клеток. Проводили математический анализ экспрессии белков в зависимости от гистологического варианта, стадии, степени дифференцировки, течения заболевания. Течение заболевания расценивали как неблагоприятное при развитии рецидива, появлении отдаленных метастазов или смерти больного от прогрессирования опухоли. Отдаленные результаты оценивали через 3 года после лечения с помощью программного обеспечения MedCalс 12, Microsoft Excel 2007 с использованием методов Каплана—Мейера (log-rank), распределение — методом сопряженных таблиц по χ², точного критерия Фишера.

Гиперэкспрессия CD44 была отмечена в 35% случаев несветлоклеточного ПКР (в 33 из 93 наблюдений): в 18 (75%) из 24 папиллярных 2-го типа, в 12 (50%) из 24 хромофобных классических, в 3 (10%) из 30 папиллярных 1-го типа (рис. 1).

Высокий уровень экспрессии белка в группе папиллярного рака 2-го типа может быть связан с более агрессивным течением этих карцином, по сравнению с другими несветлоклеточными опухолями [10]. Отсутствие экспрессии при светлоклеточном раке, вероятно, можно объяснить небольшим числом исследованных опухолей или экспрессией клетками опухоли других изоформ белка [11].

Выявлены значимые различия экспрессии CD44 в опухолях разных стадий как в целой выборке, так и в каждой исследованной группе (табл. 1;

При оценке зависимости гиперэкспрессии CD44 от степени дифференцировки в группе несветлоклеточных опухолей значимых результатов получено не было. Среди высоко- и умереннодифференцированных карцином высокий уровень экспрессии CD44 отмечен в 19% случаев (в 18 из 93), в группе низкодифференцированных — в 16% (в 15 из 93). При оценке папиллярного рака 2-го типа обнаружено значимое преобладание гиперэкспрессии CD44 в низкодифференцированных опухолях (см. табл. 1).

Результаты анализа свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия CD44 ассоциирована с сокращением времени безрецидивной выживаемости. Этот показатель составил 67 мес у больных с низким уровнем экспрессии CD44 и 44 мес при высокой экспрессии маркера. Прогнозируемая 5-летняя выживаемость при гиперэкспрессии белка составила 18%, при низком уровне экспрессии — 70%, (рис. 2;

Гиперэкспрессия EMA отмечена в 49 (50%) из 93 случаев несветлоклеточного рака и в 7 (58%) из 12 светлоклеточного рака (рис. 3).

В исследуемой группе гиперэкспрессия чаще (в 55% случаях) выявлялась в хромофобном классическом раке реже (в 33% случаях) — в хромофобном эозинофильном, значимых результатов распределения белка в зависимости от гистологического типа не получено. Отмечено, что в светлоклеточных карциномах EMA экспрессируется интенсивнее, чем в несветлоклеточных, однако эта разница незначима. Результаты оценки реакции с учетом гистологического типа, стадии и степени дифференцировки опухолей представлены в табл. 2.

В группе несветлоклеточных опухолей гиперэкспрессия EMA значимо чаще выявлялась при продвинутых стадиях заболевания и в опухолях низкой степени дифференцировки (метод χ², p<0,001). При оценке отдельных гистологических типов данное распределение по стадиям было аналогичным для всех, кроме хромофобного эозинофильного рака (см. табл. 2). По нашим данным, уровень экспрессии ЕМА значимо не влияет на безрецидивную выживаемость больных.

Гиперэкспрессия E-cadherin отмечена в 43 (46%) несветлоклеточных карциномах: в 10 (33%) папиллярных опухолях 1-го типа, в 5 (21%) — 2-го типа, в 19 (79%) — хромофобных эозинофильных, в 9 (60%) — хромофобных классических (рис. 4).

Кроме того, выявлено снижение экспрессии E-cadherin при повышении стадии в группе хромофобного эозинофильного рака и в целом при несветлоклеточном ПКР (метод χ², p<0,01). Однако при анализе группы папиллярного рака 2-го типа увеличение стадии сопровождалось значимым усилением экспрессии (критерий Фишера, р<0,05; см. табл. 3). Последнее, возможно, объясняется относительно малым числом наблюдений.

Среди опухолей с низким уровнем экспрессии белка во всех гистологических вариантах преобладали карциномы III—IV стадии (рис. 5;

При оценке экспрессии маркера в опухолях разной степени дифференцировки статистически значимых закономерностей не отмечено (см. табл. 3). Высоко- или умереннодифференцированные несветлоклеточные опухоли с гиперэкспрессией E-cadherin составили 29% (27 из 93 наблюдений), низкодифференцированные — 17% (16 наблюдений). В свою очередь, низкий уровень белка в указанных группах составил 26% (24 наблюдения) и 28% (26 наблюдений) соответственно. При оценке времени безрецидивной выживаемости прогностического значения гиперэкспрессия E-cadherin не имела (p>0,05).

В результате исследования экспрессии молекул адгезии разными вариантами несветлоклеточного ПКР установлено, что гиперэкспрессия CD44 является независимым неблагоприятным фактором прогноза несветлоклеточного ПКР. Этот белок значимо чаще выявляется в папиллярном раке 2-го типа, а уровень его экспрессии нарастает при III—IV стадии всех вариантов несветлоклеточных карцином. Белки EMA и E-cadherin могут рассматриваться как потенциальные прогностические маркеры несветлоклеточного ПКР, так как уровень их экспрессии значимо ассоциирован со стадией, а в некоторых группах — и со степенью дифференцировки: гиперэкспрессия ЕМА увеличивается при снижении степени дифференцировки и повышении стадии, E-cadherin при тех же условиях снижается. Для окончательного определения прогностической значимости ЕМА и E-cadherin необходимо провести исследование, включающее большее число наблюдений.