Выявление ранней стромальной инвазии при плоскоклеточных неоплазиях шейки матки чаще всего не представляет больших трудностей. Это обусловлено четкостью эпителиально-стромальной границы и архитектурными особенностями многослойного плоского эпителия. Каплевидная инвазия в зоне цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) распознается относительно легко, чего нельзя сказать об аденокарциноме in situ шейки матки (AIS). Чтобы идентифицировать инвазию, необходимо четко различить железистые структуры с AIS, вовлекающей предсуществующие крипты и инвазивные железы, что бывает не просто, особенно в высокодифференцированных аденокарциномах. С другой стороны, доброкачественные железистые поражения иногда создают иллюзию инвазивного роста. В свете этих особенностей железистых поражений особенно актуальным становится поиск показательных маркеров стромальной инвазии. В настоящей работе предпринята попытка оценить возможности применения в качестве маркеров стромальной инвазии белки CD44, Е-кадгерин, β-катенин, тенасцин, ламинин.

CD44 — это многофункциональное семейство трансмембранных белков [11]. Существует большое количество изоформ CD44 (около 20), экспрессирующихся в различных клетках человеческого организма. Лигандами CD44 являются гиалуроновая кислота и другие компоненты внеклеточного матрикса: коллаген, ламинин, фибронектин и хондроитинсульфат. CD44 вовлечен в межклеточные связи, во взаимодействия клеток с матриксом, в клеточную миграцию, адгезию, презентацию хемокинов и ростовых факторов, передачу ростовых сигналов, участвует в захвате и внутриклеточной деградации гиалуроновой кислоты и передаче сигналов гемопоэза и апоптоза [13]. Эти функции очень важны для таких процессов, как хроническое воспаление и развитие злокачественных опухолей [11]. Отдельные изоформы могут отвечать за метастазирование раковых клеток и инвазию [10, 11, 17]. C. Biesold и соавт. [1] показали корреляцию между экспрессией CD44v6 и инвазией в лимфатические сосуды, а также общим количеством метастазов в лимфатических узлах таза при раке шейки матки. Позднее корреляция между экспрессией CD44v6 и инвазией в лимфоваскулярное пространство была подтверждена, и высказано предположение, что клетки опухоли, имеющие на поверхности этот белок, могут «притворяться лимфоцитами» и использовать их пути распространения [17]. Сообщения о характере распределения CD44v6 противоречивы. В нормальном плоском эпителии шейки матки распределение белка ограничено базальным слоем и никогда не наблюдается в поверхностных слоях [6]. При CIN экспрессия CD44 и некоторых его изоформ (CD44v4 и CD44v6) уменьшается с увеличением степени неоплазии [4, 7]. Значительно снижается его экспрессия при инвазивной плоскоклеточной карциноме [15]. Данные об экспрессии CD44 при диспластических изменениях железистого эпителия и аденокарциноме шейки матки крайне скудны. Диспластические изменения железистого эпителия шейки матки и аденокарцинома демонстрируют положительную реакцию с антителами к одной из изоформ CD44 (CD44v5), в то время как в нормальном железистом эпителии этот маркер не экспрессируется [9].

В эпителиальной ткани основную роль в поддержании морфологии клетки играет Е-кадгерин [20]. Он участвует не только в соединении клеток между собой, но и в передаче сигналов между клетками и внутрь клетки, а также активно вовлечен в регуляцию клеточной пролиферации и подвижности [2, 8, 19]. Е-кадгерин, будучи центральным звеном межклеточных взаимодействий, играет определенную роль в опухолевой прогрессии и инвазии во многих типах новообразований [16]. Изменения в опосредованных белком межклеточных взаимодействиях приводят к изменению фенотипа клеток, увеличению способности к инвазии, подвижности и т.д. [18]. Многочисленные иммуногистохимические (ИГХ) исследования показали изменение экспрессии Е-кадгерина при прогрессировании неопластического процесса: уменьшение окрашивания мембраны и увеличение цитоплазматического окрашивания, иногда полное отсутствие реакции при утяжелении процесса неоплазии плоского эпителия [2, 7].

Некоторые авторы [20] считают Е-кадгерин маркером инвазии и метастазирования. Было показано, что существует статистически значимая корреляция между сниженной экспрессией Е-кадгерина в плоскоклеточном раке шейки матки и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, у 72% пациентов с метастазами отмечено снижение содержания Е-кадгерина (28% — без метастазов). Данные об экспрессии Е-кадгерина при различных изменениях железистого эпителия шейки матки и аденокарциноме крайне скудны. Имеются сообщения о снижении экспрессии Е-кадгерина совместно с β-катенином при аденокарциноме шейки матки [12].

Тенасцин — гликопротеид внеклеточного матрикса. Во взрослом организме тенасцин экспрессируется в различных тканях, в том числе в области эпителиально-стромального соединения. Его экспрессия усиливается при воспалительно-реактивных процессах, а также в строме некоторых опухолей. В нормальных тканях влагалищной порции шейки матки и вульвы данный белок выявляется в виде тонкой полоски в непосредственной близости от локализации экспрессии ламинина. Тенасцин может считаться маркером ранней инвазии, так как его экспрессия при микроинвазивном и инвазивном плоскоклеточном раке шейки матки сильно возрастает по сравнению с CIN [3]. При аденокарциноме шейки матки экспрессия тенасцина не изучена.

Ламинин входит в состав базальных мембран. При всех доброкачественных, а также большинстве интраэпителиальных неопластических процессах базальная мембрана окрашивается равномерно, нарушения целостности отсутствуют. При воспалении и склерозе стромы наблюдаются очаговые нарушения целостности базальных мембран. При исследовании аденокарцином шейки матки обнаружено, что они могут строить собственные базальные мембраны, однако эти данные противоречивы. Существует мнение о том, что при микроинвазивных аденокарциномах базальная экспрессия ламинина отсутствует, но при этом в зоне инвазии опухоли наблюдается цитоплазматическая экспрессия ламинина [14].

β-Катенин является связующим звеном между Е-кадгерином и актиновыми филаментами цитоплазмы. Катенины и их комплексы не только действуют как «межклеточный клей», но и представляют собой интегральный компонент системы передачи сигналов через мембрану в цитоплазму и ядро клеток (Wnt-сигнальный путь). При всех аденокарциномах шейки матки независимо от гистологического типа происходит снижение экспрессии α- и β-катенинов [12]. Однако в отличие от плоскоклеточного рака шейки матки накопление β-катенина в ядре не происходит [5].

Настоящее исследование включает следующие случаи: доброкачественные железистые изменения (53), дисплазия и аденокарцинома in situ (66) и инвазивная аденокарцинома (47). Во всех случаях мы наблюдали сочетанные поражения в виде доброкачественных, предраковых изменений эпителия и аденокарциномы шейки матки. Для ИГХ-исследования использовали панель моноклональных антител (табл. 1)

С парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 4 мкм, которые монтировали на высокоадгезивные стекла (Polysine Slides, «Menzel GmbH&Co KG», Германия). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов выполняли при помощи специализированной системы EnVision Flex («Dako», Дания) при 95—98 °С, рН 9,0 в течение 20 мин в модуле предобработки к автостейнеру (PT-Module). ИГХ-реакции проводили в автоматизированном режиме с помощью автостейнера Dako. В качестве системы детекции применяли систему EnVision Flex («Dako», Дания) с DAB-хромогеном. После проведения реакции срезы докрашивали гематоксилином (1—3 мин) и заключали в бальзам. В каждой серии препаратов использовались соответствующие положительные и отрицательные контроли. Препараты изучали под световым микроскопом Leica DM 4000 с использованием системы Leica Application Suite и цифровой камеры высокого разрешения Progres C14. Для оценки экспрессии применяли полуколичественный метод анализа. Анализ результатов проводили при помощи пакета программ Statistica 6.0, используя U-тест Манна—Уитни для двух независимых групп данных. Уровень значимости (p) принимали равным 0,05.

В нормальном железистом эпителии шейки матки, а также при доброкачественных изменениях наблюдали гетерогенную мембранную экспрессию CD44. Умеренную и выраженную экспрессию отмечали в 52% случаев в нормальных железах и в 47% случаев при различных доброкачественных поражениях. Реакция в клетках стромы отсутствовала. При предраковых изменениях железистого эпителия экспрессию CD44 выявляли в 94% случаев дисплазии I степени, в 87,5% случаев дисплазии II степени, в 93% случаев дисплазии III степени и в 85% наблюдений аденокарциномы insitu(табл. 2).

В строме, окружающей доброкачественные изменения железистого эпителия, экспрессию тенасцина не выявляли ни в одном наблюдении. Обнаружена слабая и умеренная экспрессия тенасцина под нормальным покровным цилиндрическим эпителием, а вокруг более глубоко лежащих желез реакция была отрицательной (см. рисунок, в). Вблизи предопухолевых изменений эпителия шейки матки также наблюдалось отсутствие экспрессии тенасцина, за исключением тех случаев, когда очаги дисплазии располагались в непосредственной близости от опухоли (5 случаев), а также очагов микроинвазии в аденокарциноме in situ (6 наблюдений). При инвазивном раке экспрессия тенасцина отмечалась в 78,7% случаев (в 2 наблюдениях — слабая, в 15 — умеренная, в 20 — выраженная) (см. рисунок, г). Необходимо отметить, что в 2 наблюдениях злокачественной аденомы, включенных в исследование, также выявлена умеренная стромальная экспрессия тенасцина, подтверждающая инвазивный характер опухоли, несмотря на обманчиво доброкачественную структуру желез и довольно четкие базальные мембраны. В 10 наблюдениях экспрессия белка отсутствовала. Нами были обнаружены статистически значимые различия экспрессии тенасцина между аденокарциномой и группами предраковых и доброкачественных изменений эпителия шейки матки (р<0,05).

Во всех группах отмечена исключительно мембранная экспрессия Е-кадгерина. Преобладала умеренная и выраженная реакция (табл. 3).

При сравнении экспрессии в нормальных железах и доброкачественных изменениях статистически значимые различия не обнаружены. При анализе групп предраковых изменений выявлена отчетливая тенденция к усилению экспрессии маркера при нарастании степени дисплазии, однако различия статистически незначимы. Следует отметить, что в большинстве инвазивных аденокарцином выявлялась выраженная мембранная экспрессия Е-кадгерина (см. рисунок, д), а отсутствие или снижение экспрессии белка наблюдалось в высокоагрессивных и низкодифференцированных опухолях (серозные, стекловидно-клеточные, мезонефральные, низкодифференцированные цервикальные карциномы). Значимые различия экспрессии Е-кадгерина между всеми исследованными группами не обнаружены (p>0,05).

Во всех случаях выявлялась мембранная экспрессия β-катенина, перераспределение маркера в ядра клеток не происходило. В исследуемых группах отмечена гетерогенная экспрессия маркера, и, несмотря на то что чаще наблюдалась выраженная экспрессия, статистически значимые различия не обнаружены (p>0,05).

Экспрессия ламинина в нормальных железах и при доброкачественных изменениях железистого эпителия выявлялась в виде очень тонкой полоски. При всех предраковых состояниях наблюдали слабую экспрессию ламинина вдоль базальной мембраны, однако в 73% случаев дисплазии III степени и аденокарцином in situ экспрессия отсутствовала. В 14 случаях аденокарцином реакция не отмечена, а в 33 случаях наблюдали выраженную цитоплазматическую экспрессию белка в 5—30% опухолевых клеток, располагающихся преимущественно вдоль зоны инвазии опухоли, или в наиболее глубоко лежащих опухолевых комплексах (см. рисунок, е). Связь экспрессии ламинина с гистологическим вариантом и степенью дифференцировки опухоли не была обнаружена (p>0,05).

При доброкачественных и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки наблюдается гетерогенная мембранная экспрессия CD44, что не может служить маркером агрессивности поражения. При аденокарциноме шейки матки в опухолевых клетках CD44 также демонстрирует фокальное и гетерогенное окрашивание, что ограничивает его применение как прогностического маркера. Высокая экспрессия CD44 в строме при инвазивных аденокарциномах шейки матки, вероятно, является следствием нарушения развития и изменений свойств стромы при опухолевом процессе и делает CD44 ценным инструментом для идентификации ранней стромальной инвазии при аденокарциноме in situ и верификации диагноза при высокодифференцированных инвазивных опухолях (таких как аденокарцинома цервикального типа и злокачественная аденома).

Экспрессия тенасцина выявлена исключительно в строме, что соответствует данным литературы. Мы наблюдали умеренную реакцию в виде полоски, находящейся под нормальным цилиндрическим и плоским эпителием шейки матки, а также в сосудах. Подобные варианты тоже описаны в литературе. Примечательно, что интенсивность реакции в группе аденокарцином шейки матки была значимо выше, чем при доброкачественных и предраковых изменениях железистого эпителия. Таким образом, данный маркер также можно использовать для выявления ранней стромальной инвазии и диагностики инвазивного рака с очень высокодифференцированными железистыми структурами.

Е-кадгерин и β-катенин экспрессировались исключительно на мембранах клеток во всех исследованных группах, при этом статистически значимые различия интенсивности окраски не обнаружены. В отличие от плоскоклеточной карциномы шейки матки накопление β-катенина в ядре не происходило, что свидетельствует, по всей видимости, об отсутствии изменений в Е-кадгерин/β-катенин/Wnt-сигнальном пути при развитии аденокарцином шейки матки.

Ламинин в нормальных железах, а также при доброкачественных и предраковых изменениях железистого эпителия экспрессировался вдоль базальной мембраны эпителия, что совпадает с данными литературы. При аденокарциномах шейки матки наблюдалось перераспределение маркера и накопление его в цитоплазме опухолевых клеток, расположенных вдоль наиболее глубоко лежащих опухолевых комплексов. Подобные наблюдения делают ламинин перспективным маркером для выявления стромальной инвазии, однако необходимы дальнейшие исследования его роли в данном процессе.

В результате исследования нами установлено, что CD44 и тенасцин представляют большую диагностическую ценность при исследовании изменений железистого эпителия шейки матки, в том числе аденокарциномы. Е-кадгерин и β-катенин не имеют диагностической и прогностической ценности в исследованных группах патологических процессов. Ламинин представляется потенциальным маркером инвазии, однако механизмы его экспрессии при аденокарциноме шейки матки требуют дальнейшего изучения.