Рак толстой кишки (РТК) занимает одно из первых мест в структуре смертности от злокачественных новообразований в развитых странах. Несмотря на усовершенствование методов диагностики, хирургического и химиотерапевтического лечения, смертность от данного заболевания остается высокой. Основным прогностическим фактором при РТК считается стадия заболевания (по системе TNM). Тем не менее в последние годы широко изучается возможность использования различных молекулярно-биологических маркеров для определения прогноза и ответа на химиотерапию [15].
Уровень экспрессии мРНК и белков зачастую сильно отличается в метастатических и первичных опухолях. Такие отличия первичного опухолевого очага и метастатических отсевов обусловливают их различную агрессивность и чувствительность к химиотерапии. Вследствие этого определение экспрессии молекул, на которые воздействуют те или иные препараты, в первичных опухолях не может служить для определения эффективности химиотерапии у пациентов с наличием метастазов [12]. Также при определении прогноза РТК необходимо учитывать экспрессию молекулярно-биологических маркеров, играющих роль в регулировании клеточной пролиферации, адгезии, инвазии и ангиогенеза не только в первичной опухоли, но и в ткани метастазов.
К прогностическим маркерам при аденокарциномах толстой кишки (АТК) относят тимидилатсинтазу (ТС) — внутриклеточный фермент, участвующий в синтезе ДНК и являющийся мишенью 5-фторурацила — одного из основных препаратов, используемых для лечения данного заболевания [8]. По данным исследований, высокий уровень ТС коррелирует с плохим ответом на химиотерапию с использованием 5-фторурацила [8, 20]. Экспрессия ТС в первичной опухоли не позволяет прогнозировать эффективность химиотерапии, основанной на применении 5-фторурацила, у пациентов с наличием метастазов; это свидетельствует о том, что уровень экспрессии данного фермента в опухоли толстой кишки отличается от такового в метастатических очагах [20].
В последнее время разработаны препараты для лечения РТК, представляющие моноклональные антитела, инактивирующие рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor — EGFR) [11, 14] и сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor — VEGF) [16]. Поскольку рост и распространение опухолей зависят от их васкуляризации, представляется важным воздействие на молекулы, регулирующие лимфо- и ангиогенез, такие как семейство VEGF. EGFR — трансмембранный рецептор, активация которого приводит к усилению пролиферации клеток, индукции ангиогенеза и метастазирования [14, 22]. В большинстве эпителиальных опухолей отмечается активация EGFR. Тем не менее существующие препараты эффективны лишь примерно в 10% случаев метастатического РТК. Экспрессия EGFR в первичной опухоли не является показателем ответа на терапию в метастатических очагах. Отличия в экспрессии данного рецептора между опухолью толстой кишки и ее метастазами могут объяснить, почему пациенты с отсутствием экспрессии в первичной опухоли отвечают на анти-EGFR терапию [22].
К наиболее прогностически важным маркерам при РТК относятся молекулы адгезии и антиадгезии, участвующие в развитии метастазов. Нарушение межклеточных соединений способствует инвазии эпителиальных клеток, приводя, таким образом, к прогрессии аденокарциномы. Комплекс Е-кадгерин—β-катенин играет важную роль в клеточной адгезии, и нарушение его функционирования приводит к увеличению инвазивного и метастатического потенциала опухолевых клеток. β-Катенин связывает Е-кадгерин с актиновым цитоскелетом через α-катенин и обеспечивает прочные межклеточные контакты [4]. Снижение уровня адгезивной молекулы Е-кадгерина выявляется во многих эпителиальных злокачественных опухолях [7].
Гликопротеин внеклеточного матрикса (ВКМ) тенасцин С (ТН С), обладающий антиадгезивными свойствами, взаимодействует с другими молекулами ВКМ и клеточными рецепторами и усиливает пролиферацию клеток, ангиогенез, инвазию и метастазирование. Повышенная экспрессия ТН С коррелирует с наличием метастазов в лимфатических узлах и плохим прогнозом РТК [15].
Фактор супрессии метастазов KAI-1 (CD82) расположен на клеточной мембране и формирует взаимосвязи с интегринами, хемокинами, ответственными за клеточную миграцию, адгезию и передачу сигналов. Снижение экспрессии KAI-1 приводит к усилению опухолевой прогрессии. Повышение содержания данной молекулы приводит к уменьшению клеточной инвазии и миграции в связи эндоцитозом EGFR [13]. В настоящее время недостаточно изучена экспрессия KAI-1 и ТН С в метастазах РТК в сравнении с экспрессией в первичных опухолях.
Изучение экспрессии факторов, регулирующих пролиферацию опухолевых клеток, индуцирующих ангиогенез и метастазирование, как в первичных опухолях, так и в метастатических очагах, может способствовать не только сопоставлению их иммунофенотипа и определению агрессивности опухоли, но и чувствительности к химиотерапии.
Целью настоящего исследования явилось сравнение экспрессии ТС, EGFR, VEGF, Е-кадгерина, β-катенина, ТН С и KAI-1 в первичных аденокарциномах толстой кишки и их метастазах в лимфатических узлах.
В исследование вошли 22 больных первичным РТК с метастазами в лимфатических узлах, у которых отсутствовали данные, указывающие на наличие гематогенных метастазов, проходивших лечение в РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского в период с 2007 по 2008 г. Морфологическому и иммуногистохимическому исследованию подвергнут послеоперационный материал опухолей толстой кишки и их метастазов в регионарных лимфатических узлах.
Фиксация ткани опухоли и лимфатических узлов проводилась в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 1 сут. Для морфологического исследования изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) выполнялось на парафиновых срезах с использованием системы визуализации Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection Sysytem/DAB (BioGenex) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Депарафинацию проводили по стандартной методике, затем осуществляли демаскировку антигенов в буфере Tris-EDTA (pH 9,0) в водяной бане при температуре 98 °C. Для выявления EGFR проводили предварительную обработку с протеиназой К. Эндогенную пероксидазу блокировали 3% H2O2. Затем срезы инкубировали с первичными антителами (табл. 1).
При исследовании с антителами к Е-кадгерину и β-катенину выявлялось окрашивание в мембране и/или цитоплазме железистых эпителиальных клеток, для β-катенина — дополнительно в ядрах опухолевых клеток. Для VEGF определяли цитоплазматическую экспрессию в железистых эпителиальных клетках и стенках сосудов опухоли. Для EFGR — цитоплазматическое и мембранно-цитоплазматическое окрашивание железистых эпителиальных клеток. При исследовании с антителами к ТС выявлялось окрашивание в цитоплазме и ядрах клеток паренхимы и стромы опухоли. Экспрессия данных маркеров отмечалась как в отдельных фокусах клеток, так и равномерно во всех опухолевых клетках. Для ТН С была характерна очаговая или диффузная экспрессия в ВКМ стромы опухоли и стенках сосудов. Оценка интенсивности экспрессии перечисленных маркеров проводилась полуколичественным методом. Отмечалась слабая, умеренная и выраженная интенсивность окрашивания.
При иммунопероксидазной реакции с антителами к KAI-1 определялась экспрессия в лимфоидных клетках стромы опухоли и/или в области лимфогистиоцитарного инфильтрата, окружающего тяжи опухолевой ткани. Количество клеток оценивалось в расчете на 10 полей зрения (ПЗ) и было разделено на три группы: 1-я группа — 0—50 клеток в 10 ПЗ, 2-я группа — 50—100 клеток в 10 ПЗ, 3-я группа — более 100 клеток в 10 ПЗ.
Для визуализации изображения использовали цифровую камеру Leica DFC.
Для статистического анализа полученных данных использовалась программа Statistica 6.1. Значимость различий между показателями маркеров при анализе опухоли и лимфатических узлов проверялась путем построения таблиц сопряженности, дополненных критерием χ2 Пирсона и критерием Фишера.
При исследовании экспрессии ТС в АТК в большинстве случаев выявлялось отсутствие иммунопероксидазного окрашивания (6 пациентов, 28,5%) и слабая интенсивность окрашивания цитоплазмы в большинстве клеток, сопровождавшаяся окраской ядра (6 пациентов, 28,5%) (см. рисунок,а).
При сопоставлении показателей экспрессии ТС в парах первичная опухоль—метастаз в лимфатическом узле у каждого пациента выявлено, что окрашивание было одинаково лишь в 3 (13,5%) случаях из 22. Отмечалось ядерное и слабое цитоплазматическое окрашивание или отсутствие экспрессии.
При сравнении экспрессии VEGF в пораженных лимфатических узлах и основной опухоли выявлено, что для первичной опухоли наиболее характерной была слабая/умеренная экспрессия в цитоплазме в отдельных фокусах опухолевых железистых эпителиальных клеток (10 пациентов, 45,5%) либо аналогичная экспрессия в эпителиальных клетках, сопровождающаяся слабой окраской стенок сосудов (7 пациентов, 32%) (см. рисунок, б), а для ткани метастазов — отсутствие иммунопероксидазного окрашивания (19 пациентов, 86,5%) (см. табл. 2). Различия были статистически значимыми (р<0,001).
Сопоставление показателей экспрессии VEGF в парах первичная опухоль—метастаз в лимфатическом узле выявило также лишь три совпадения (13,5%): в двух случаях иммунопероксидазное окрашивание отсутствовало и в одном отмечалось слабое цитоплазматическое окрашивание эпителиальных клеток.
При сравнительном анализе особенностей экспрессии EGFR в метастазах в лимфатических узлах и в первичной опухоли выявлено, что для ткани основной опухоли наиболее характерным показателем было отсутствие экспрессии маркера (10 случаев, 45,5%) либо слабое мембранно-цитоплазматическое окрашивание (7 случаев, 32%) (см. рисунок, в), а для пораженных лимфатических узлов — умеренная/выраженная мембранно-цитоплазматическая экспрессия (13 случаев, 59%) (см. табл. 2, рисунок, г). Различия между показателями экспрессии EGFR при анализе первичной опухоли и лимфатических узлов были статистически достоверны (р=0,025).
Сравнив экспрессию EGFR в АТК и ее метастазах в лимфатических узлах у каждого пациента, мы выявили 9 случаев с одинаковыми показателями (41%). Для 6 пациентов было характерно слабое/умеренное мембранно-цитоплазматическое окрашивание, для 3 — отсутствие окрашивания.
При изучении экспрессии Е-кадгерина в АТК с одинаковой частотой встречалась слабая интенсивность окрашивания цитоплазмы фокусов клеток либо равномерно всех эпителиальных клеток (см. рисунок, д), а также слабая либо выраженная интенсивность мембранно-цитоплазматического окрашивания части клеток (по 5 случаев, 23%). Для большинства пораженных лимфатических узлов (8 пациентов, 36,5%) было характерно слабое мембранно-цитоплазматическое окрашивание части опухолевых клеток (см. рисунок, е); в 6 случаях (27%) было отмечено отсутствие экспрессии маркера (см. табл. 2). При сравнении экспрессии Е-кадгерина в первичной опухоли и пораженных лимфатических узлах выявлены статистически достоверные различия (р=0,0022).
Экспрессия Е-кадгерина была одинаковой в АТК и метастатических поражениях у 3 (13,5%) пациентов и характеризовалась как слабая либо умеренная мембранно-цитоплазматическая.
При сравнении показателей экспрессии β-катенина в лимфатических узлах с показателями маркера в основной опухоли выявлено, что в обоих случаях была наиболее характерна выраженная интенсивность окрашивания мембраны и цитоплазмы отдельных фокусов клеток: в 12 (54,5%) случаях — в первичной опухоли и в 10 (45,5%) случаях — в клетках метастазов аденокарциномы в лимфатических узлах (см. табл. 2). Статистически значимых различий между группами не выявлено (р=0,07).
Исследование экспрессии данного маркера в парах первичная опухоль—метастаз в лимфатическом узле показало, что она была одинакова в 7 (32%) случаях. У 5 пациентов выявлялась мембранно-цитоплазматическая экспрессия слабой либо умеренной интенсивности, у 1 пациента — ядерная и умеренная/выраженная цитоплазматическая экспрессия и у еще 1 — ядерное и слабое мембранно-цитоплазматическое окрашивание.
По данным ИГХ-исследования с антителами к ТН С в большинстве случаев АТК и пораженных лимфатических узлов также отмечались сходные показатели — умеренная/выраженная очаговая экспрессия в ВКМ стромы, сопровождающаяся умеренной/выраженной окраской стенок сосудов в 10 (45,5%) случаях АТК и 17 (77%) случаях метастазов. Однако у остальных пациентов иммунореактивность маркера отличалась в первичной опухоли и метастазах в регионарных лимфатических узлах (см. табл. 2). Различия между показателями экспрессии ТН С при анализе первичной опухоли и лимфатических узлов были статистически достоверны (р=0,04).
Сопоставление показателей экспрессии данного маркера в первичной АТК и метастазах в лимфатических узлах показало, что и там, и там отмечалось умеренное очаговое окрашивание стромы и стенок сосудов опухолевой ткани в 10 (45,5%) случаях.
При ИГХ-исследовании экспрессии KAI-1 наиболее часто в первичной опухоли встречалось окрашивание ≤50 клеток стромы в 10 ПЗ (8 случаев, 36,5%) и окрашивание клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата, сопровождающееся окраской клеток стромы, общим количеством ≤50 клеток в 10 ПЗ (6 случаев, 27%). В метастазах в лимфатических узлах наиболее характерным показателем являлось отсутствие экспрессии маркера (17 случаев, 77%) (см. табл. 2). Различия между группами статистически достоверны (р=0,0001).
При сравнении экспрессии KAI-1 в первичной опухоли и ее метастазах в лимфатических узлах выявлено, что она была одинакова лишь в 2 (9%) случаях. У 1 пациента отмечалось окрашивание ≤50 клеток стромы в 10 ПЗ и у 1 — отсутствие окрашивания.
Поскольку экспрессия различных молекулярно-биологических маркеров в опухолевой ткани зачастую гетерогенна, то характеристики, выявленные в первичной опухоли, могут отличаться от таковых в метастазах в лимфатических узлах. В различных исследованиях показана иммунофенотипическая и генетическая внутриопухолевая гетерогенность РТК [1, 2]. В нашем исследовании экспрессия большинства маркеров (ТС, VEGF, EGFR, Е-кадгерина, ТН С и KAI-1), исследованная с помощью иммуногистохимии, достоверно отличалась в первичной опухоли и метастазах в лимфатических узлах. При сравнении в парах первичная опухоль—метастаз выявлено, что у большей части пациентов экспрессия ТС, VEGF, Е-кадгерина, β-катенина, KAI-1 была различна. Показатели экспрессии EGFR и ТН С совпадали в 41 и 45,5% случаев соответственно.
По полученным нами данным, при исследовании экспрессии ТС выявлено, что она отсутствовала в метастазах в лимфатических узлах у большинства пациентов и была в основном невысокой в первичных АТК. Достоверно различаются также показатели экспрессии мРНК ТС в АТК и метастазах в печени и лимфатических узлах [20]. Такие различия в показателях экспрессии свидетельствуют о том, что необходимо определять содержание данного маркера не только в первичной опухоли, но и в метастазах, поскольку экспрессия ТС в метастазах является предиктором ответа на химиотерапию с использованием 5-фторурацила. У пациентов, у которых выявляется низкая экспрессия ТС в пораженных лимфатических узлах, отмечается бóльшая выживаемость после хирургического лечения, поэтому определение данного маркера в метастазах может служить прогностическим маркером для пациентов, получивших только хирургическое лечение [15].
У большинства пациентов отсутствовала экспрессия VEGF в метастазах в лимфатических узлах и была преимущественно слабой/умеренной в первичных АТК. Содержание VEGF, являющегося позитивным регулятором ангиогенеза, увеличивается в опухолевых тканях. Невысокий уровень экспрессии VEGF может быть связан с влиянием различных условий на рост сосудов в зоне опухоли, в том числе с полиморфизмом гена VEGF [5]. Тем не менее различные показатели VEGF в первичной опухоли и метастатических очагах свидетельствуют о необходимости исследовать его содержание перед применением препаратов направленного действия.
В нашем исследовании экспрессия EGFR достоверно различалась: отсутствовала либо была слабой мембранно-цитоплазматической в первичной опухоли у большинства пациентов и, напротив, преимущественно умеренной/выраженной мембранно-цитоплазматической в метастазах. Высокое содержание EGFR в пораженных лимфатических узлах ассоциировано с плохой выживаемостью в отличие от аналогичного содержания маркера в первичной опухоли [6]. При сравнении пар первичная опухоль—метастаз в лимфатическом узле нами выявлено 9 (41%) случаев с одинаковыми показателями экспрессии, из них 6 со слабым/умеренным мембранно-цитоплазматическим окрашиванием. Наличие экспрессии EGFR в первичной АТК и пораженных лимфатических узлах ассоциировано с более низкой выживаемостью, чем отсутствие экспрессии [6]. Существующие в настоящее время данные об экспрессии EGFR в первичных АТК и метастазах в печени и лимфатических узлах противоречивы: в одних исследованиях обнаружен значительный процент случаев с одинаковой экспрессией, в других — напротив, с различной [6, 14, 18, 22]. Поэтому у пациентов РТК с метастазами определение EGFR только в первичной опухоли недостаточно для выбора терапии, направленной на EGFR.
При подавлении активности молекул адгезии клетки приобретают способность отделяться от окружающей ткани. По полученным нами данным, в метастазах АТК в лимфатических узлах экспрессия Е-кадгерина в целом была более слабой, чем в первичной опухоли. Сходные результаты получены и другими авторами при сравнении первичной опухоли с метастазами как в лимфатических узлах, так и в печени [3, 7]. В нашем исследовании больных РТК экспрессия молекулы адгезии β-катенина достоверно не отличалась в сравниваемых группах, однако в целом также была выше в первичной опухоли, чем в метастазах. Это может быть обусловлено тем, что метастазируют клетки с более низкой экспрессией молекул адгезии Е-кадгерина, β-катенина, а также воздействием окружающей ткани лимфатического узла, где сформировался метастаз [7]. Снижение содержания β-катенина в метастазах по сравнению с первичной опухолью ассоциировано с худшими показателями выживаемости [10].
Экспрессия ТН С, способствующего отделению клеток от их окружения, в нашем исследовании была умеренной или высокой у большей части пациентов, и при сравнении двух групп оказалось, что в целом она была более выраженной в ткани метастазов в лимфатических узлах, чем в основной опухоли. В других исследованиях схожие данные получены для метастазов в печени [9]. При сопоставлении экспрессии данного маркера в парах первичная опухоль—метастазы в лимфатических узлах выявлено наибольшее количество одинаковых показателей среди всех изученных нами маркеров — 45,5%.
В нашем исследовании в первичных АТК выявлялась преимущественно небольшая экспрессия KAI-1, но в метастазах в лимфатических узлах отсутствовала у большинства пациентов, что согласуется с данными других авторов [19, 21]. Известно, что экспрессия фактора супрессии метастазов KAI-1 уменьшается с прогрессией РТК [19].
Таким образом, в нашем исследовании показано, что экспрессия ряда молекулярно-биологических маркеров, используемых для определения прогноза и выбора терапии РТК (ТС, VEGF, EGFR, Е-кадгерин, β-катенина, ТН С и KAI-1), различна в первичных опухолях и метастазах в лимфатических узлах, поэтому недостаточно проводить их определение только в первичной опухоли. Их экспрессия в метастазах может служить показателем агрессивности опухоли и иметь прогностическое значение. Для применения показателей экспрессии этих молекулярно-биологических маркеров в клинической практике необходимо проведение исследования на большем количестве больных.