Пролиферирующая веррукозная лейкоплакия (ПВЛ) — особая и агрессивная форма лейкоплакии, которая в настоящее время в классификации ВОЗ рассматривается как потенциально злокачественное заболевание слизистой оболочки рта (СОР) [1]. Этиология ПВЛ все еще остается невыясненной [2, 3], однако хорошо известно, что она плохо поддается терапии и характеризуется высокой частотой рецидивирования и неопластической трансформации в веррукозную карциному (ВК) или плоскоклеточный рак (ПР) СОР [2, 4]. По данным разных авторов [3, 5—7], неоплазия может развиться в 40—100% случаев в течение 4,4—11,6 года. По этой причине ПВЛ должна быть выявлена как можно раньше. Клинически различают 4 стадии развития ПВЛ: 1 — белый плоский очаг кератоза, 2 — диффузные и множественные белые пятна, 3 — медленнорастущие образования с веррукозной (бородавчатой) поверхностью, на которой имеются эритематозные участки и 4 — веррукозная карцинома или плоскоклеточный рак СОР. При этом гистологически могут выявляться: веррукозный гиперортокератоз (ВГ), веррукозная карцинома (ВК) и плоскоклеточный рак СОР.

Наиболее спорным вопросом является наличие дисплазии при ПВЛ. В классификации ВОЗ от 2017 г. указано, что дисплазия появляется на последних клинических стадиях этого заболевания перед развитием ВК или ПР. Однако имеются данные о том, что злокачественная опухоль формируется на стадии множественных белых пятен, поэтому можно предположить, что ПВЛ без стадии дисплазии переходит в ВК [1]. Поэтому актуальной задачей является поиск новых диагностических критериев, позволяющих на ранних стадиях заболевания оценить злокачественный потенциал ПВЛ.

В настоящее время для оценки злокачественного потенциала опухоли имеется большое количество иммуногистохимических маркеров. Наиболее информативным является определение пролиферативной активности с помощью выявления белка Ki-67 [8]. В диагностике дисплазии может помочь и изучение цитоплазматического цитокератина 15 (СК15). Ранее было показано, что при дисплазии отмечается выраженная экспрессия этого белка в цитоплазме клеток плоского эпителия, однако на начальной стадии неоплазии и при ПР его экспрессия резко снижается [9].

Цель исследования — изучить особенности неопластической трансформации эпителиальных клеток слизистой оболочки рта при веррукозном гиперортокератозе, веррукозной карциноме и плоскоклеточном раке слизистой оболочки рта.

Материал и методы

В работе использован операционный материал отделения хирургической стоматологии и архивный материал лаборатории патологической анатомии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Минздрава России за период с 2013 по 2019 г. Были исследованы биоптаты СОР 33 пациентов (26 женщин и 7 мужчин; средний возраст 63,7 года) с клиническим диагнозом: пролиферирующая веррукозная лейкоплакия СОР. В 19 (57,6%) случаях на основании гистологического исследования был установлен диагноз ВГ, в 8 (24,2%) — ВК и в 6 (18,2%) случаях — ПР.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследования биопсийного материала проводили в соответствии со стандартным протоколом [10]. Тканевые антигены определяли с помощью моноклональных кроличьих антител к белкам Ki-67 (Clone SP6, Cell Marque) и мышиных моноклональных антител к цитокератину 15 (СК15) (ЕР14, Epitomics). Для визуализации антигенов использовали двойное окрашивание системой Ultra Vision LP Detection System AP Polymer and Fas Red Chromogen и QUANTO DAB.

Индекс пролиферации (ИП) по Ki-67 определяли по процентному отношению клеток с иммунореактивными ядрами к общему числу клеток. Экспрессию белка СК15 эпителиальными клетками оценивали по интенсивности окрашивания цитоплазмы: 0 — реакции не отмечалось; 1 — слабое окрашивание; 2 — умеренное окрашивание; 3 — интенсивное окрашивание.

Большая часть пролиферирующих клеток при ВГ, ВК локализована в нижних слоях эпителия, поэтому оценку экспрессии белков Ki-67 и СК15 проводили в 300 клетках ростковой зоны эпителия (мальпигиев слой), к которой относятся базальный слой и 2 вышележащих ряда клеток. При ПР СОР оценивали клетки периферической зоны опухоли. Периферическую зону ПР сравнивали с ростковым слоем при ВГ и ВК. Подсчет клеток производили при ×400.

Для количественной оценки результатов проводили морфометрические исследования. Статистический анализ осуществляли при помощи программы Statistica 10.0 в среде Windows10. С помощью W-критерия Шапиро—Уилка определяли нормальность распределения полученных показателей, при нормальном распределении указывали среднюю и среднее квадратичное отклонение (M+S), при ненормальном распределении — медианы (M_е), 25-й и 75-й процентили признаков (Q₁; Q₃). Проверку однородности выборок осуществляли с помощью Н-критерия Краскела—Уоллиса. Достоверность различия отдельных выборок определяли с помощью t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна—Уитни, различия считали статистически значимыми при р<0,05. Корреляционные отношения между ИП клеток и синтезом белка СК15 оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Для изучения пролиферативной активности клеток и синтеза белка СК15 в настоящем исследовании проведено двойное окрашивание, которое заключается в одновременном окрашивании ядер пролиферирующих клеток в красный цвет (Fast Red) и цитоплазмы эпителиоцитов, содержащих СК15, в коричневый (DAB). При проведении исследования 33 биопсий в 19 случаях выявлен ВГ: утолщение рогового слоя, гиперплазия шиповатого слоя эпителия и широкие акантотические эпителиальные выросты в собственную пластинку СОР (рисунок, а). В 8 случаях отмечался гиперкератоз с атипией клеток мальпигиева слоя на фоне хронического воспалительного инфильтрата в собственной пластинке СОР, что соответствует ВК (см. рисунок, б). В 6 случаях ПК на фоне выраженного гиперкератоза установлено отсутствие базальной мембраны и инфильтрирующий рост многослойного плоского эпителия с выраженной клеточной атипией в собственную пластинку СОР (см. рисунок, в).

Исследование пролиферативной активности по ядерному белку Ki-67 при ВГ и ВК показало наличие иммунопозитивных клеток только в ростковом слое, однако количество пролиферирующих клеток при ВК было значительно выше, чем при ВГ (см. рисунок, г, д). При ПР также отмечалась высокая пролиферация эпителиальных клеток (см. рисунок, е). Количественные показатели пролиферативной активности эпителиальных клеток при ВГ, ВК и ПР представлены в таблице.

Примечание. Достоверные различия: * — между группами 1—2, 1—3 (р<0,001), ** — между группами 1—2, 1—3 (р<0,001), *** — между группами 2—3 (р=0,045).

Цитоплазматический белок СК15 хорошо визуализировался при ВГ в ростковом слое (см. рисунок, а, г, ж). При ВК иммуногистохимическая реакция на данный маркер отмечалась лишь в отдельных эпителиальных клетках без признаков атипии (см. рисунок, з). При ПР ИГХ-реакция в опухолевых эпителиальных клетках практически отсутствовала (см. рисунок, е, и; таблица).

Из представленных в таблице данных видно, что при ВК и ПК по сравнению с ВГ СОР отмечается увеличение пролиферативной активности клеток в исследуемых участках. Наиболее выраженная экспрессия белка СК15 наблюдается при ВГ СОР с интенсивным окрашиванием цитоплазмы базального и парабазального слоев клеток. Синтез этого белка при ВК полностью отсутствует, а при ПР резко снижен в периферической зоне опухолевых очагов.

Достоверные различия пролиферативной активности клеток в ростковом слое и периферической зоне опухоли отмечались между ВГ и ВК (t=-6,2; p<0,01), ВГ и ПР (t=-4,2; p<0,01), при сравнении ВК и ПР различия были недостоверными (t=-1,4; p=0,20).

При проведении рангового дисперсионного анализа синтеза белка СК15 установлена неоднородность сравниваемых показателей в группах по критерию Краскела—Уоллиса. Для росткового слоя и периферической зоны опухолей Н-критерий составил 24,9 (p<0,01).

По интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток по белку СК15 в ростковом слое достоверные различия установлены между ВГ и ВК (U=0; p<0,01), ВГ и ПР (U=5,0; p<0,01), ВК и ПР (U=8,0; p=0,045).

При исследовании корреляционных взаимоотношений установлена достоверная слабая отрицательная корреляция между ИП и синтезом белка CK15 в ростковом слое и периферической зоне опухоли (r=-0,394; p<0,05).

Повышение пролиферативной активности клеток является одним из важных звеньев патогенеза опухолевого роста. Белок Ki-67, который окрашивает ядра во всех фазах, кроме G0, считается универсальным маркером пролиферирующих клеток [8, 10]. Исследования показали увеличение количества иммунопозитивных клеток в мальпигиевом слое при ВК по сравнению с ВГ, однако в отдельных участках пролиферация клеток была такая же, как и при ВГ, поэтому особое внимание следует уделить степени выраженности дисплазии. По данным ВОЗ, к признакам эпителиальной дисплазии относятся изменения гистоархитектоники тканей, такие как нарушение рядности клеток, исчезновение полярности клеток базального слоя, акантоз, увеличение фигур митоза, наличие митоза в поверхностных слоях эпителия, преждевременная кератинизация клеток, кератиновые «жемчужины» в области акантоза, потеря межклеточных контактов и структуры клеток: клеточный и ядерный полиморфизм, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения, наличие патологических митозов, увеличение количества и размеров ядрышек, гиперхромазия [1]. В наших исследованиях показано, что при ВГ тканевая и клеточная атипия отсутствует, в то время как при ВК отмечаются нарушение рядности клеток и выраженная ядерная атипия. Относительно дисплазии при ВК мнения ученых разделились: Mehrotra и соавт. полагают, что при ВК клеточная атипия минимальная или отсутствует [11], Р. Speight [12] отмечает дисплазию в 50% случаев потенциально злокачественных образований.

Ранее мы установили, что в процессе злокачественной трансформации от эпителиальной гиперплазии СОР в ПР экспрессия белка промежуточных филаментов цитоскелета цитокератина 15 претерпевает определенные изменения. При эпителиальной гиперплазии он обнаруживается только в ростковом слое, при дисплазии эпителия появляется в цитоплазме клеток шиповатого слоя, а при раке in situ и ПР не экспрессируется в опухолевых клетках [9]. В настоящем исследовании показано наличие данного белка в эпителиальных клетках росткового слоя только при ВГ, а при ВК опухолевые клетки не экспрессируют этот белок. Анализируя ИГХ-реакцию с белком СК15, можно заключить, что по сравнению с эпителиальной гиперплазией с гиперкератозом, клинически представленной лейкоплакией СОР, в случае трансформации ВГ в ВК не наблюдается переходных форм, характеризующих диспластические изменения эпителия. Настоящее исследование показало, что ВК по характеру пролиферативной активности, клеточной атипии и особенностям экспрессии белка СК15 опухолевыми клетками соответствует раку in situ. Таким образом, пролиферирующая веррукозная лейкоплакия не только клинически является самостоятельной нозологической формой, но и морфологически имеет свой особый путь злокачественной трансформации, при котором переход ВГ в ВК осуществляется без стадии дисплазии.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при опухолевой трансформации пролиферирующей веррукозной лейкоплакии в веррукозную карциному и плоскоклеточный рак отсутствует стадия дисплазии эпителия. Веррукозная карцинома по характеру пролиферативной активности, клеточной атипии и экспрессии цитокератина 15 соответствует раку in situ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.И.Б., А.А.И.

Сбор и обработка материала — В.А.С., О.Ф.Р.

Статистическая обработка — И.И.Б., А.А.И.

Написание текста — И.И.Б., А.А.И.

Редактирование — И.И.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.