Идиопатический нефротический синдром является одним из основных клинических проявлений гломерулопатий, составляя около 15—30% от общего числа [1]. При этом основными его патоморфологическими проявлениями являются болезнь минимальных изменений (БМИ), мембранозная нефропатия (МН) и фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), которые мы относим к формам непролиферативных гломерулопатий (НПГП) среди патоморфологических паттернов гломерулярных патологий в МКБ-10 [2]. Установлено, что на клеточном уровне ключевым фактором, участвующим в развитии массивной протеинурии при данном синдроме, являются подоциты [3, 4]. При этом субмикроскопически выявляли слияние цитоподий, а также их гибель и слущивание с поверхности гломерулярной базальной мембраны (ГБМ) с последующим ее «оголением» (ОГБМ) [5].

Эти изменения ассоциируются с повреждением белков цитоскелета, в частности синаптоподина и актина, в результате повышения активности кальциневрина (серин-треонин-фосфатаза), чему, однако, могут противодействовать применяемые в клинике ингибиторы кальциневрина [6]. Своевременное выявление повреждений подоцитов существенно для прогнозирования характера заболевания, в частности развития гломерулосклероза (ГС) [7, 8].

Наряду с указанными выше данными показано, что слияние цитоподий подоцитов с ОГБМ не всегда коррелирует со степенью выраженности протеинурии [9, 10].

Цель исследования — изучить возможную взаимосвязь ультраструктурных изменений подоцитов и степень ОГБМ при НПГП с клинико-лабораторными показателями состояния гломерулярного фильтра.

В обследуемую группу включены 37 пациентов (23 мужчины, 14 женщин). В зависимости от морфологически идентифицируемого варианта нефропатии больных распределили по следующим группам: фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) — 8, мембранозная нефропатия (МН) — 17, болезнь минимальных изменений (БМИ) — 12. Все пациенты при объединении формировали группу больных НПГП, а при исключении из нее больных мембранозной нефропатией – группу больных подоцитопатиями.

У всех пациентов был проанализирован клинический вариант течения нефропатии (азотемия, наличие артериальной гипертензии и ее степень, длительность и характер мочевого синдрома), а также выполнены стандартные лабораторные и инструментальные исследования, в частности определены уровень общего холестерина сыворотки крови (в ммоль/л); содержание общего белка сыворотки крови (г/л); альбумина сыворотки крови (АСК) (г/л); скорость клубочковой фильтрации (СКФ) по EPI (мл/мин/1,73 м²); суточная потеря белка (СПБ) (г/сут).

Кроме того, в соответствии с клиническими данными, но безотносительно их полу, больные были разделены на две группы: лица с нефротическим синдромом (НС+) и лица без такового (НС–).

Для патогистологического исследования образцы почечной паренхимы фиксировали незамедлительно после их получения в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 24 ч при комнатной температуре. После стандартной обработки (обезвоживание, пропитка, заливка) из заключенных в парафиновые блоки образцов приготовляли серийные срезы размером 3—4 мкм (ESM-350, ERMA Япония), которые окрашивали гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа (PAS), использовали также трихромальную окраску (Masson), по Джонсу, Вейгерту (Veigert), Конго красным. Исследование проводили в светооптическом микроскопе («Carl Zeiss Imager Z 2», Германия). Патоморфологические изменения оценивали количественно; учитывали общее число клубочков с раздельной регистрацией полностью склерозированных и/или с фокально-сегментарным склерозом; последние рассматривали как проявления так называемого ГС.

Иммуномаркирование на криостатных срезах проводили методом прямой флюоресценции с использованием FITC-меченых антител (DAKO, Дания) к IgA, IgM, IgG, C3c, C1q, фибриногену, а также легких цепей каппа (κ) и лямбда (λ). Для ультраструктурного анализа биоптаты фиксировали в стандартном альдегидном фиксаторе, затем в четырехокиси осмия и заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали на трансмиссионном микроскопе JEМ 7A (Япония). Исследования проводили на базе лаборатории электронной микроскопии отдела патологии НИЦ и лаборатории клинической иммунологии и морфологии НИИ нефрологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Измерения ширины слияния цитоподий (ЦП) подоцитов проводили в соответствии с известным методом [10]. В настоящем исследовании 5—10 полей одного или двух клубочков от каждого пациента фотографировали при оригинальном увеличении в 10 000 раз. Исследование сканированных электронограмм ЦП и состояния щелевой диафрагмы выполняли при помощи программы Image J Software (NIH, 1997).

Арифметические значения ширины цитоподий (ШЦП) высчитывали по формуле: ШЦП = 4 (Σ ГБМ длина/Σ количество ЦП подоцитов) для каждого пациента и группы в виде медианы с межквартильным размахом. Подсчитывали количество ЦП на гломерулярной базальной мембране. ЦП определяли как любой цитоплазматический сегмент подоцита, прилежащий к базальной мембране клубочка между двумя фильтрационными порами или щелевыми диафрагмами (рис. 1).

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (Statistica 8.0 для Windows). Использовали стандартные методы параметрической и непараметрической статистики. Данные в таблицах представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения в случае правильного распределения, медианы и межквартильного размаха при неправильном распределении. Для сравнительного анализа между группами использовали тесты kрускела—Уоллиса и Манна—Уитни U-тest при р besides<0,05, соответственно корреляционный анализ осуществляли посредством Spearman Rank order Correlations с вычислением коэффициента R при р<0,05.

Результаты основных клинико-лабораторных параметров в нозологических группах больных представлены в табл. 1.

В группах больных НПГП преобладали мужчины — 62,1% от общего числа всех пациентов. Достоверной разницы между группами по возрастному критерию не обнаружено. Средний возраст по всей когорте больных составил 43,3±16,9 года. Суточная протеинурия была ниже всего при ФСГС. По уровню альбумина сыворотки крови наибольшие значения наблюдали при ФСГС. В то же время СКФ у этих пациентов была наиболее низкой, хотя и соответствовала критериям так называемой возрастной нормы показателей (м/ж 40—50 лет, 61—120/58—110) [11].

Наиболее высокий уровень общего холестерина отмечался в группах пациентов с М.Н. Следует отметить, что полученные данные не являются статистически достоверными. Как и следовало ожидать, при НПГП количество больных с НС+/НС– составило 27/10 (табл. 2).

Светооптическая микроскопия. При НПГП наибольшее количество склерозированных клубочков, т. е. таковых с ГС, наблюдалось при ФСГС. При этом значение ГС было достоверно (р<0,05) больше, чем в двух остальных подгруппах (БМИ и МН). При этом объединение больных в группы с НС+ и НС– достоверной разницы по ГС между ними не выявило, хотя по абсолютным показателям количество ГС в группе с НС– было больше, чем в другой.

Степень выраженности ГС в группах больных НПГП имела отрицательную корреляционную зависимость с СКФ, оцененную методами СКФ по EPI (r=–0,45; р<0,05) и полностью отсутствовала между ГС и показателями суточной протеинурии и/или уровнями АСК. Корреляционные взаимосвязи отсутствовали между ГС и ШЦП (R =–0,23; p=0,15) и процентом ОГБМ (R=–0,28; p=0,08).

При иммуноморфологическом исследовании методом прямой иммунофлюоресценции исследуемые иммуноглобулины, фракции комплемента и фрагменты легких цепей выявляли в структурах клубочков типичных для исследованных патологий. Так, при БМИ только отложения IgM, λ низкой интенсивности (1+ –2+) отмечались фокально-сегментарно в мезангиальном матриксе клубочков. Для ФСГС было характерно интенсивное отложение продукта реакции (2+–3+) на IgM, λ и C3c в зонах склерозирования капиллярных петель клубочков. У больных МН продукт реакции на IgG, C3c, λ стандартно располагался диффузно-глобально вдоль базальной мембраны капилляров клубочков.

При МН абсолютное значение ширины ножковых отростков было больше, чем в двух других группах больных. Вместе с тем в этой же группе значение «оголения» базальных мембран гломерул было наименьшим по сравнению с остальными группами (рис. 2, а).

Анализ статистических значений ШЦП и процентом ОГБМ в группах больных с нефротическим синдромом и без такового обнаружил сходное с нозологическими группами колебание значений ШЦП и ОГБМ, причем различия ШЦП в соответствующих группах были статистически достоверными (p<0,05) (см. рис. 2, б).

Количественные значения ШЦП были связаны с уровнем суточной потери белка (R=0,47; p<0,05) и уровнем альбумина в сыворотке крови больных (R=–0,57; p<0,05) (рис. 3, а,

Значения ШЦП и СКФ не были между собой связаны (r=0,045; p=0,8), так же как и ОГБМ и СКФ (r=0,23; p=0,18).

Корреляционный анализ значений ШЦП и ОГБМ среди больных НПГП подтвердил статистически недостоверную (r =–0,31; p<0,061) отрицательную зависимость этих морфометрических показателей, характеризующих морфофункциональное состояние подоцитов на ультраструктурном уровне (рис. 4, а).

Подоциты являются постмитотическими клетками, функция которых зависит от их узкой специализации, во многом обусловленной уникальной структурой цитоскелета. Считают, что подоциты обеспечивают по крайней мере четыре различные функции: регуляция селективной клубочковой проницаемости [12] вместе с мезангиальными клетками — структурная поддержка клубочковых капилляров [13], наряду с эндотелиальными и мезангиальными клетами — ремоделирование клубочковой базальной мембраны (GBM) [14], эндоцитоз фильтрованных в первичную мочу белков [15]. Функция подоцита зависит от их сложной многокомпонентной архитектоники, включающей: 1) комплекс щелевой диафрагмы; 2) клеточный цитоскелет с актином в основе и связанных с ним белков и молекул адгезии; 3) микроокружение подоцитов, включая базальную мембрану (GBM), к которой они крепятся [16]. Одним из исследовавшихся в настоящей работе ультраструктурных проявлений дисфункции подоцитов был процесс слияния цитоподий при НПГП. Ранее уже было показано, что при этом нормальная трехмерная архитектура подоцитов утрачивается. Так, актиновый цитоскелет подвергается реорганизации, конденсируясь в узкой полоске цитоплазмы, прилегающей к плазматической мембране, что сопровождается изменением структуры щелевидных диафрагм [3]. Клинически указанные изменения при НПГП сопровождаются протеинурией, а нередко и нефротическим синдромом [10].

Указанные изменения согласуются и с нашими данными (см. табл. 1), причем наиболее выраженная протеинурия и нефротический синдром (см. табл. 2) оказались при болезни минимальных изменений и М.Н. Поскольку количественное определение ШЦП считают наиболее убедительным критерием, позволяющим использовать именно данную методику. Так, выяснилось, что в отличие от других работ [8, 10] различия значений ШЦП оказались недостоверными. Объединенный (вне нозологический) корреляционный анализ определил наличие связи между степенью выраженности ШЦП, тяжестью протеинурии (уровень СПБ) и АСК (см. рис. 3, а, б) у больных НПГН и в группе пациентов с нефротическим синдромом, причем это согласуется с наблюдениями некоторых, хотя далеко не всех авторов [18], находясь в явном противоречии с другими [10].

Несмотря на указанные различия, полученные результаты скорее всего представляются более убедительными, поскольку коррелируют с признанной многими концепцией о прямой зависимости между глубиной выраженности повреждения цитоскелета подоцитов, с одной стороны, и степенью протеинурии — с другой. При этом пусковым механизмом указанного повреждения при нефротической протеинурии в подавляющем большинстве случаев иммунных и неиммунных гломерулопатий является слияние цитоподий подоцитов [6], что, однако, не исключает и иных интерпретаций, требующих специальных исследований.

Слияние цитоподий подоцитов в случае прекращения воздействия патогенных факторов является, по-видимому, обратимым процессом. Однако при длительном влиянии они могут нарастать и становиться необратимыми с исходом в ГС [19].

В представленном исследовании не была выявлена связь между ГС и ШЦП, а также процентом ОГБМ. В то же время зависимость между ГС и СКФ была установлена, что представляется вполне закономерным, поскольку оба показателя отражают количество утративших функцию нефронов и тем самым могут служить важным предиктором терминальной почечной недостаточности [20].

По мнению ряда авторов [21, 22], одним из этапов повреждения подоцитов с высокой вероятностью развития ГС считают процессы «оголения» отдельных участков базальной мембраны, которые сопровождаются слущиванием подоцитов с последующим исходом в подоцитопению гломерул, причем оба эти процесса ассоциируются с массивной протеинурией. Именно это обстоятельство побудило нас наряду с определением ШЦП предпринять подсчет процента ОГБМ, имея также в виду данные о том, что избыточная протеинурия при ряде заболеваний может развиваться и без слияния цитоподий [22]. Результаты показали, что различия по проценту ОГБМ между больными не отмечались независимо от их группировки как по нозологическим, так и по синдромальным характеристикам. Помимо этого, статистической корреляции процента ОГБМ со степенью выраженности ГС не выявлено. Эти данные несколько противоречат результатам других исследователей [23], поскольку в работе упомянутые авторы рассматривали материал, полученный только от больных сахарным диабетом (в нашем исследовании — НПГН), а кроме того, были существенные расхождения и в методике оценки. Так, в работе учитывались отдельные участки оголения базальных мембран, а в исследовании цитируемых выше авторов — образцы с тотальным слущиванием висцеральных клеток клубочкового эпителия.

Взаимоотношения процента ОГБМ с СПБ и АСК (при сопоставлении с параметрами ШЦП) послужили аргументом в пользу проведения корреляционного анализа количественных показателей ШПЦ и ОГБМ (см. рис. 4, а, б). Полученные результаты свидетельствуют о наличии выраженной недостоверной отрицательной корреляционной зависимости между ШЦП и процентом ОГБМ в группе больных с НПГП (БМИ + ФСГС + МН) и достоверной в группе больных с подоцитопатиями (БМИ + ФСГС).

В качестве гипотезы, объясняющей отрицательную корреляцию между ШЦП и процентом ОГБМ, можно предположить, что на самых ранних этапах повреждения (1-й этап) между ЦП подоцита или рядом располагающихся подоцитов появляются участки мембран, не покрытые щелевой диафрагмой, так называемые участки транзиторного «оголения». В случае перехода на 2-й этап [3] слияния ЦП при активации «распластывания» и гипертрофии подоцитов эти зоны уменьшаются в размерах. С общетеоретической точки зрения выявленные изменения отражают, на наш взгляд, концепцию о том, что структурная модификация подоцитов в виде слияния ЦП является превентивно-адаптационной реакцией клеток на возможность слущивания с поверхности ГБМ в условиях стресса и действия повреждающих факторов [3].

В экспериментах, моделирующих массивную протеинурию с нефротическим синдромом, установлен факт слущивания подоцитов [24]. Аналогичные изменения наблюдали и у больных с идиопатическим ФСГС, а также при амилоидозе, диабете и ряде иных патологий [21]. В то же время слущивание подоцитов практически не документировано при БМИ и при наследственном нефротическом синдроме, т. е. при состояниях с выраженным нефротическим синдромом и слиянием ножковых отростков подоцитов [25].

Учитывая результаты проанализированных работ, мы полагаем, что выраженность патологических изменений, таких как ШЦП и процент ОГБМ, не является следствием протеинурии, а в первую очередь зависит от патогенеза каждого конкретного заболевания, что согласуется и с данными других авторов, например [10]. Как показали данные настоящей работы, решающими факторами повреждения нефрона являются тяжесть клинических проявлений, а также срок начала стартовых симптомов и их динамика, причем совокупность этих признаков особенно наглядна при разработанной нами системе ультраструктурного анализа. Указанную систему, основанную на опубликованных ранее методических приемах, можно считать оригинальной, если рассматривать ее как единое целое, хотя вклад достижений наших предшественников тоже с благодарностью принят во внимание [27].

В заключение отметим, что представляется перспективным дальнейшее исследование патологии почек с использованием уже разработанных алгоритмов, причем существенное место в таких работах должно занять иммуномаркирование патогенетически значимых структур.

Таким образом, результаты настоящего исследования позволяют сделать следующие выводы.

Разработан оригинальный методический подход к ультраструктурному исследованию ряда распространенных видов патологии почки. У больных НПГП выявлена зависимость между выраженностью нефротического синдрома и протеинурии/гипоальбуминемии, с одной стороны, и ШЦП — с другой. У больных НПГП выявлена зависимость между СКФ и количеством склерозированных гломерул. Установлена отрицательная связь между ШЦП и процентом ОГБМ в подгруппе больных с подоцитопатиями.

Участие авторов:

Концепция, дизайн исследования — В.Г.С., А.В.С.

Сбор и обработка материала — В.Г.С.

Статистическая обработка — В.Г.С.

Написание текста — В.Г.С., А.И.Н., А.В.С.

Редактирование — И.В.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Неворотин А.И. — д-р биол. наук, проф., зав. лаб. электронной микроскопии отдела патологии; http://orcid.org/0000-0003-0631-5751; e-mail: nevorotinai@1spbgmu.ru

Авсиевич И.В. — ст. лаборант лаб. электронной микроскопии отдела патологии; http://orcid.org/0000-0001-6680-9345; e-mail: uirkl26@mail.ru ;

Смирнов А.В. — д-р мед. наук, проф.; e-mail: nii_nephrologii@mail.ru

Сиповский В.Г. — http://orcid.org / 0000-0002-1512-8037; e-mail: sipovski@mail.ru