Гетерогенность опухолевых клеток является одним из наиболее серьезных вызовов в современной онкологии [1—3]. Различные популяции клеток с разными молекулярно-биологическими свойствами в рамках одной опухоли формируют ее особый профиль, уникальный для каждого пациента. Подобная гетерогенность, вероятно, связана с разным функциональным состоянием опухолевых клеток и разной их функциональной нагрузкой в ходе процессов опухолевого роста и прогрессии. В то же время оценка гетерогенности популяций опухолевых клеток в составе различных клеточных кластеров является очень важной задачей, позволяющей реализовывать инновационные персонализированные подходы к диагностике онкологических заболеваний.

В глиальных опухолях изучение гетерогенности клеточной популяции привело к выявлению в глиобластомах особого класса клеток — глиомных стволовых клеток (ГСК), которые по своим молекулярно-биологическим свойствам отличаются от окружающих их опухолевых клеток и формируют прогениторный клеточный пул, служащий источником появления новых опухолевых клеток [4]. При этом по своим генетическим и биологическим особенностям данная популяция схожа с нейрональными стволовыми клетками [5]. Многие авторы полагают, что именно ГСК являются главными виновниками нечувствительности опухоли к химио- и лучевой терапии, а также служат одной из основных причин рецидивирования злокачественных глиом после хирургического лечения [6]. Более того, было показано, что ГСК образуют скопления в областях с наиболее выраженными гипоксическими условиями, что отражает формирование ими внутри опухоли своеобразного клеточного стволового кластера [7]. В то же время вопрос гетерогенности опухолевой клеточной популяции, очевидно, изучен недостаточно. Можно предположить наличие различных популяций опухолевых клеток с разнообразными функциональными молекулярно-биологическими свойствами, входящих в состав одной опухоли. Они могут формировать отдельные кластеры или небольшие скопления в отдельных участках опухолевого узла, а могут распределяться более равномерно.

Необходимо отметить, что ряд вопросов клеточной гетерогенности в глиобластомах остается неизученным. Одним из традиционных маркеров пролиферативного потенциала исследуемой ткани является белок Ki-67. Интересным представляется изучение пролиферативного потенциала различных пулов клеток и выявление гетерогенности распределения данного показателя в отдельных клеточных популяциях.

С другой стороны, малоизученными остаются вопросы состояния процессов апоптоза и его ингибирования в различных популяциях опухолевых клеток и соотношения этих процессов с пролиферативным потенциалом в отдельных клеточных кластерах. Показано, что белок Bcl-2 обладает свойствами ингибирования процессов апоптоза и способствует выживанию опухолевых клеток, в том числе в глиобластоме [8].

Важное место в патогенезе онкологического процесса занимает и поддержание пролиферативного потенциала и пролиферативной активности клеток. Одним из факторов, обеспечивающих эти процессы в клетках глиобластомы, является белок BCL6. Он представляет собой ядерный фактор транскрипции, выступающий в качестве глобального регулятора экспрессии генома, способствующего реализации пролиферативных программ и инактивации антионкогенных механизмов, в том числе репарации ДНК и апоптоза [9].

В данной работе провели комплексную оценку функционального молекулярно-биологического статуса различных популяций опухолевых клеток. Для этого с помощью традиционных иммуногистохимических морфометрических методов и модифицированного варианта метода histoscore с применением модификации изображения и выделением отдельных клеточных кластеров оценили гетерогенность экспрессии пролиферативного маркера Ki-67, ингибитора процессов апоптоза Bcl-2, обеспечивающего выживание опухолевых клеток и поддержание их пролиферативного потенциала, белка BCL6 в различных популяциях опухолевых клеток в образцах глиобластомы.

Формирование групп исследования

В ретроспективное, слепое, рандомизированное исследование включены 20 образцов опухолей от пациентов с установленным диагнозом глиобластомы без мутации в гене IDH1 (WHO Grade IV), проходивших хирургическое лечение в ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» в 2017 и 2018 г.

Средний возраст пациентов на момент операции составлял 60,05±2,15 года, при этом мужчины составили 55% (n=11), женщины — 45% (n=9). Среди мужчин средний возраст на момент операции составлял 58,64±2,42 года, в то время как в группе женщин – 61,78±3,85 года.

Из парафиновых блоков с фиксированными в них образцами опухолей изготавливали срезы толщиной 3 мкм, депарафинировали с использованием ксилола и повторно гидратировали с помощью различных концентраций этанола, срезы высушивали в термостате при 45 °C. Затем срезы последовательно инкубировали с кроличьими моноклональными антителами к антигену Ki-67 человека (CONFIRM anti-Ki67, «Roche-Ventana»), мышиными моноклональными антителами к антигену человека Bcl-2 (CONFIRM anti-Bcl-2, «Roche-Ventana»), мышиными моноклональными антителами к антигену человека BCL6 (клон GI191E/A8, CellMarque, «Sigma-Aldrich», США), мышиными моноклональными антителами к антигену человека CD 45 (клон 2B11, PD7/26, CellMarque, «Sigma-Aldrich», США), GFAP (клон EP672Y, CellMarque, «Sigma-Aldrich», США) и после этого конъюгировали с антикроличьими мышиными IgG антителами к пероксидазе хрена. Сайты связывания антител визуализировали с использованием тетрагидрохлорида 3,3’-диаминобензидина («Ventana Medical Systems», США), ядра клеток окрашивали гематоксилином.

Для проведения первичного пространственного морфометрического анализа и преобразования изображений ткани опухоли использовали микроскоп Carl Zeiss Scope. A1, Axiocam 105 color («Zeiss AG», Германия) и программы для формирования и анализа изображений ZEN 2 («Zeiss AG», Германия), ImageJ (NIH, США) и Adobe Photoshop («Adobe Systems», США). Проводили калибровку цветовых показателей изображения, фотографировали различные участки опухолевой ткани, подвергнутые иммуногистохимическому окрашиванию серийных срезов. После этого изображения одного и того же участка опухолевой ткани с экспрессией различных маркеров накладывали друг на друга и с помощью программных компьютерных инструментов совмещали с изменением цвета меток, что позволяло выделить экспрессию маркеров Ki-67, Bcl-2 и BCL6 именно в опухолевых клетках.

Проводили пространственный анализ гетерогенности экспрессии маркеров Ki-67, Bcl-2 и BCL6 в различных популяциях опухолевых клеток. Для анализа использовали простой подсчет процента клеток, экспрессирующих данный маркер (для Ki-67 индекс мечения — ИМ, для Bcl-2 и BCL6 процент клеток — ПК), в различных клеточных популяциях двумя опытными патологами, не знакомыми с исходными данными пациентов. Также применяли полуколичественный метод histoscore, при котором процент клеток с слабоположительным окрашиванием (низкая интенсивность экспрессии) умножали на 1, процент клеток с умеренно положительным окрашиванием (средняя интенсивность экспрессии) умножали на 2 и наконец процент клеток с сильноположительным окрашиванием (высокая интенсивность экспрессии) умножали на 3, после чего результат суммировали [10]. При этом для оценки степени выраженности экспрессии маркеров применяли колориметрическое исследование с помощью эталонной модели CIE XYZ. Для этого с помощью вышеуказанного программного обеспечения определяли суммарные средние значения по красной кривой (X), зеленой кривой (Y) и синей кривой (Z). После этого программным способом вычисляли средние колориметрические показатели (СКП) для каждой метки в отдельности. В случае если СКП составлял 170 и более, интенсивность экспрессии считали низкой, при значении СКП 85 и более — средней и при показателе СКП менее 85 активность экспрессии считали высокой.

Статистическую обработку проводили с помощью программного обеспечения SPSS 17.0 (IBM, США) и Statistica 10 («StatSoft», США). Для определения достоверности различий показателей активности экспрессии маркеров в различных популяциях клеток применяли U-критерий Манна—Уитни. Различия считали достоверными при p<0,05.

В ходе анализа гетерогенности распределения экспрессии маркеров Ki-67, Bcl-2 и BCL6 удалось выделить пять клеточных популяций, отличающихся по уровню экспрессии вышеперечисленных маркеров.

Первый кластер располагается непосредственно вокруг некрозов, в связи с чем его назвали перинекротическим. Среднее значение ИМ Ki-67 в данном кластере (при суммировании показателей у всех пациентов) составило 6,83±0,5%, значение по histoscore составило 62,46±2,25% (рис. 1, а—з).

Второй кластер окружает первый, располагаясь непосредственно вокруг него. Условно назвали описываемый пул клеток транзиторным некротическим. Клетки данного кластера в сравнении с клетками перинекротического кластера демонстрируют более высокий уровень как ИМ Ki-67, среднее значение которого составило 18,39±0,56%, так и показателя по histoscore, составившего в среднем 112,65±2,76% (cм. рис. 1, д—з). При этом необходимо отметить, что данные различия носили статистически достоверный характер как для показателей ИМ, так и для значений histoscore (p<0,0001; z=5,40 и p<0,0001; z=5,39) (рис. 2, а,

Третий кластер располагается непосредственно вокруг сосудов и, подобно перинекротическому, назван периваскулярным. В данном кластере наблюдались относительно высокие значения ИМ и histoscore Ki-67, составившие в среднем 22,23±1,4 и 118,59±3,36% (рис. 3, а—г).

Четвертый кластер располагается вокруг периваскулярного и аналогично второму назван транзиторным васкулярным. Показатели И.М. и histoscore Ki-67 в данном кластере ниже по сравнению с периваскулярным кластером, они составляют 8,37±0,35 и 75,48±2,04% (см. рис 3, а, б), причем приведенные различия достигают уровня статистической значимости (p<0,0001, z =–5,40 и p<0,0001,z=–5,40) (рис. 4, а,

Наконец, пятый кластер охватывает большую часть оставшейся опухолевой ткани и опухолевых клеток, условно назвали его промежуточным. Средние значения ИМ и histoscore Ki-67 в нем составляют 10,68±0,39 и 95,73±2,37% (рис. 5),

Кроме того, интересные данные получены при сравнении между собой двух кластеров с относительно невысокой пролиферативной активностью. Так, значения ИМ Ki-67 в перинекротическом кластере статистически достоверно ниже по сравнению с транзиторным васкулярным кластером (p=0,0223, z=–2,29), также различаются и показатели histoscore Ki-67 в этих кластерах (p= 0,0002, z=–3,74). При изучении активности экспрессии Ki-67 в кластерах с относительно высокими его значениями показано, что ИМ статистически достоверно выше в периваскулярном кластере по сравнению с транзиторным некротическим кластером (p=0,0102, z=2,57), в то время как различия в histoscore Ki-67 не достигают уровня статистической достоверности (p=0,2793, z=1,082).

Гетерогенность опухолевых клеток в рамках одной опухоли привлекает значительное внимание исследователей уже длительное время. Именно неоднородность клеточных популяций и наличие существенных различий в функциональном и молекулярно-биологическом состоянии клеток могут играть ключевую роль не только в патогенезе онкологического процесса, но и в формировании нечувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим и радиологическим воздействиям, а также в определении прогноза заболевания [11] и возможности метастазирования [12].

Одним из ключевых клеточных элементов в неоднородной популяции опухолевых клеток считается опухолевая стволовая клетка, описанная при целом ряде онкологических процессов, в том числе и в глиобластоме [13]. Предполагается, что может существовать несколько вариантов иерархии популяций опухолевых клеток, которые в конечном счете сводятся к двум основным типам взаимодействий и взаимоотношений стволовых и нестволовых опухолевых клеток: это формирование конечно дифференцированных опухолевых клеток из стволовых без возможности их реверсии к стволовому состоянию и формирование обычных опухолевых клеток из стволовых, способных к стволовой реверсии и приобретению прогениторного потенциала [14].

В то же время не вызывает сомнений, что описанные выше взаимоотношения не исчерпывают всей сложной, многоуровневой и гетерохронной структуры взаимодействий различных клеточных популяций. К тому же, вполне вероятно, существует больше двух молекулярных и функциональных типов клеток. Так, A. Patel и соавт. [15], применяя методику single-cell РНК-секвенирования, показали, что для клеток, отобранных из пяти образцов глиобластом, характерна значительная гетерогенность активации клеточных транскрипционных программ. Этот подход позволил выделить четыре принципиальных кластера клеток в опухолях по их молекулярной активности: клетки с активацией протоонкогенных сигнальных каскадов, с активацией систем клеточной пролиферации, повышенной экспрессией компонентов системы комплемента/иммунного ответа и повышенной экспрессией гипоксических факторов.

Таким образом, опухолевая ткань предстает комплексной, сложно устроенной системой с многочисленными плейотропными взаимодействиями, направленными на прогрессирование опухоли, повышение степени ее инвазивности и снижение чувствительности к лечебным воздействиям. Более того, эта система крайне пластична и изменчива, что лежит в основе процесса опухолевой эволюции [14]. Подобная пластичность и изменчивость, реализуемая, с одной стороны, на фоне сложных взаимосвязей внутренних факторов опухолевой системы, а с другой — отчасти порождаемая самой «механикой» этой системы, ведет не только к сегрегации опухолевой клеточной популяции, но и к появлению функционально различных клеточных популяций, что находит свое отражение в их протеомических, генетических и эпигенетических свойствах.

При этом значительную роль в этих процессах, по-видимому, играют так называемые опухолевые клеточные ниши. Они формируют своеобразную микросреду для каждой клеточной популяции, с одной стороны, создавая определенные условия для функционирования, но, с другой, — оказывая влияние на процессы развития и дифференцировки клеток, модифицируют их свойства и функциональную активность. В одном из исследований, проведенных на модели опухолевых клеток с активацией каскада рецептора тромбоцитарного фактора роста, показано, что экспрессия оксида азота (NO) сильно возрастает в эндотелиоцитах опухолевых сосудов, прилегающих к периваскулярным клеткам глиомы, экспрессирующим белки нестин, Notch и рецептор NO. Кроме того, активация сигнального пути NO/цГМФ повышает активность Notch-каскада в клетках глиом in vitro. Также было выявлено, что NO увеличивает способность клеток первичной культуры глиомы формировать нейросферы и усиливает их канцерогенный потенциал in vivo. Потеря активности NO подавляет активность Notch-каскада in vivo и увеличивает выживаемость на мышиной модели. Обнаружено, что этот механизм сохраняется и в человеческих глиомах с амплификацией гена PDGFR. Таким образом, за счет эффектов NO вокруг сосудов формируются наиболее благоприятные условия для появления и персистирования ГСК [16].

Вторая ниша, в которой чаще всего локализуются ГСК, — это перинекротическая зона опухоли. Она описана вокруг очагов некрозов, и центральную роль в формировании этой ниши играют гипоксия и индуцируемые гипоксией факторы 1-го и 2-го типа [17]. Более того, показано, что в различных отделах палисадных структур вокруг некрозов выявляются клетки с экспрессией маркеров ГСК, например CD 133. При этом, по-видимому, многие ГСК в этой нише могут испытывать значительную гипоксию, поэтому они, вероятно, несколько менее активны в сравнении с ГСК в периваскулярной нише [18]. Однако подробный кластерный анализ распределения экспрессии стволовых маркеров в отдельных клеточных популяциях не проводился.

Приведенные выше данные согласуются с полученными результатами. Наибольшая пролиферативная активность, оцениваемая по маркеру Ki-67, обнаружена в клеточном кластере, расположенном непосредственно вокруг сосудов и названном периваскулярным. Здесь же, исходя из данных литературы, локализуется наиболее активная популяция ГСК, которые, скорее всего, и обеспечивают столь высокий уровень пролиферации. К тому же периваскулярный кластер характеризуется достаточно высоким уровнем антиапоптозного фактора Bcl-2. Таким образом, по-видимому, периваскулярный кластер выступает в качестве наиболее активной клеточной популяции в глиобластоме, обусловливая ее прогрессирование и рецидивирование.

В данной работе удалось выделить и охарактеризовать 5 клеточных кластеров в глиобластоме. При этом наиболее активным кластером, несущим наибольший потенциал для прогрессирования и рецидивирования опухоли, оказался периваскулярный кластер, что согласуется с данными литературы: периваскулярная зона является наиболее важной нишей для ГСК, вносящих значительный вклад в злокачественный потенциал глиобластомы. Пато- и морфогенез опухоли представляют собой переплетение различных комплексных факторов, реализация которых в рамках сложного, многоуровневого гетерохронного процесса приводит к сегрегации опухолевых клеток и появлению отдельных клеточных популяций, описанных в данной работе. Именно поэтому требуется создание новых, более тонких и высокоточных подходов к диагностике опухолей, и в частности глиобластом, позволяющих сделать опухолевую диагностику и лечение по-настоящему высокотехнологичными и персонализированными. Мы попытались разработать фундаментальную базу для подобных подходов, выделив 5 клеточных кластеров в ткани глиобластомы. Эти исследования могут иметь не только важное практическое, но и фундаментальное значение для изучения базовых механизмов патогенеза глиобластомы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.П.В., Р.М.В.

Сбор и обработка материала — Н.П.В., Р.М.В., З.И.В., П.Т.Н., Ш. С.В.

Статистическая обработка — Н.П.В.

Написание текста — Н.П.В., Р.М.В., З.И.В.

Редактирование — Н.П.В., Р.М.В., З.И.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Никитин П.В. — e-mail: PNikitin@nsi.ru; https://orcid.org/0000-0003-3223-4584

Рыжова М.В. — e-mail: MRizhova@nsi.ru; https://orcid.org/0000-0001-7206-6365

Зубова И.В. — e-mail: Izubova@nsi.ru; https://orcid.org/0000-0002-0625-8550

Панина Т.Н. — https://orcid.org/0000-0001-6156-0085

Шугай С.В. — https://orcid.org/0000-0001-8079-8523