Стукань А.И.

ГБУЗ «Клинический онкологический диспансер №1» Минздрава Краснодарского края, Краснодар, Россия

Чухрай О.Ю.

ГБУЗ «Клинический онкологический диспансер №1» Минздрава Краснодарского края, Краснодар, Россия

Порханов В.А.

ГБУЗ «Научно-исследовательский институт — Краевая клиническая больница №1 им. проф. С.В. Очаповского» Минздрава Краснодарского края, Краснодар, Россия;
ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Краснодар, Россия

Бодня В.Н.

кафедра онкологии с курсом торакальной хирургии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов Кубанского государственного медицинского университета Минздрава России, Краснодар, Россия

Взаимосвязь экспрессии p53 и p16INK4A с клинико-морфологическими характеристиками больных плоскоклеточным раком головы и шеи

Журнал: Архив патологии. 2019;81(3): 12‑18

Просмотров : 945

Загрузок : 23

Как цитировать

Стукань А.И., Чухрай О.Ю., Порханов В.А., Бодня В.Н. Взаимосвязь экспрессии p53 и p16INK4A с клинико-морфологическими характеристиками больных плоскоклеточным раком головы и шеи. Архив патологии. 2019;81(3):12‑18.
Stukan AI, Chukhray OYu, Porkhanov VA, Bodnya VN. Association of the expression of p53 and p16INK4A with the clinical and morphological characteristicsof patients with head and neck squamous cell cancer (in Russian only). Arkhiv Patologii. 2019;81(3):12‑18. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/patol20198103112

Авторы:

Стукань А.И.

ГБУЗ «Клинический онкологический диспансер №1» Минздрава Краснодарского края, Краснодар, Россия

Все авторы (4)

На основании данных группы по изучению генома раковых заболеваний The Cancer Genome Atlas (TCGA), где выявлены различия в механизмах и путях регуляции клеточного цикла плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ), сформированы две группы ПРГШ по признаку ассоциации с вирусом папилломы человека (ВПЧ) ВПЧ-позитивным и ВПЧ-негативным раком [1]. Установлено, что эти две группы имеют различные механизмы канцерогенеза, уникальный мутационный профиль и экспрессируют характерные молекулярные маркеры. Предполагается, что патогенез ВПЧ-ассоциированного ПРГШ связан с нарушением пути белка ретинобластомы (pRb), а ВПЧ-негативные опухоли зачастую развиваются вследствие возникновения мутаций гена-супрессора опухолевого роста ТР53 [2].

Путь белка ретинобластомы (pRb) и роль экспрессии p16INK4A при ПРГШ

Комплекс Rb-E2 °F является значимой системой регуляции клеточного цикла и основной мишенью для канцерогенеза, ассоциированного с вирусом папилломы человека [3, 4]. Транскрипционный фактор E2 °F в норме связан и представлен в комплексе с белком pRb. E2 °F выполняет функцию контроля транскрипции значительного числа генов, вовлеченных в регулирование клеточного цикла, апоптоза и поддержание стабильности генома [4]. При ВПЧ-позитивном ПРГШ инактивация пути Rb достигается посредством экспрессии протеина ВПЧ Е7, который связывается с RB1 и отменяет необходимость остановки механизма p16INK4A. Как результат, происходит экспрессия белка р16 в опухолевых клетках, что подтверждает ВПЧ-позитивный статус опухоли при иммуногистохимическом анализе [5]. Независимо от вариантов терапии пациенты с орофарингеальной плоскоклеточной карциномой (ОФПКК) и гиперэкспрессией р16 имеют лучшие прогноз и клинические исходы. Недавние исследования [6] продемонстрировали значимую корреляцию между экспрессией p16INK4A в качестве суррогатного маркера ВПЧ-инфекции и прогнозом при ОФПКК с выявлением ВПЧ в опухоли. В исследовании R. Klaes и соавт. [7] окрашивание p16INK4A определялось как негативное (менее 1% позитивных клеток), спорадическое (менее 5% позитивных клеток), фокальное (менее 25% позитивных клеток) или диффузное (более 25% позитивных клеток). Другие исследователи [8—10] определяли гиперэкспрессию p16INK4A как интенсивное и диффузное (цитоплазматическое и ядерное) окрашивание 70% клеток и более.

Иммуногистохимическое выявление экспрессии р53 при ПРГШ

Предполагается, что мутации р53 не должны играть ведущую роль в ВПЧ-индуцированном туморогенезе в связи с тем, что ВПЧ проявляет канцерогенные свойства путем инактивации регуляторов клеточного цикла р53 и pRb. Это связано с экспрессией онкопротеинов E6 и E7.

Выявление экспрессии белка p53 в исследованиях может свидетельствовать о наличии как мутированного, так и дикого типа протеина p53, поскольку используемые во многих исследованиях моноклональные антитела (МКА) для детекции р53 способны связываться с мутированным и немутированным типами белка p53 [11].

Цель исследования — выявить экспрессию молекулярных маркеров р53 и p16INK4A при ПРГШ и оценить их влияние на клинические, морфологические характеристики опухоли и показатели общей выживаемости больных ПРГШ.

Материал и методы

Объект исследования и дизайн

Исследованы гистологические блоки и медицинская документация 55 больных ПРГШ, проходивших лечение на базе ГБУЗ КОД № 1 Краснодара с 2011 по 2016 г. Лечение проведено согласно локализации, распространенности и принятым локальным методам. Срез данных по клиническим исходам заболевания проведен в декабре 2017 г. В исследование ретроспективно включали больных гистологически подтвержденным плоскоклеточным раком небных миндалин, мягкого неба, стенок ротоглотки, корня и тела языка, имеющих гистологический блок ткани опухоли, приемлемый для иммуногистохимического анализа, и с доступными данными по распространенности, методам лечения и исходам заболевания.

Иммуногистохимический анализ экспрессии p16INK4A и р53

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах автоматизированным методом на иммуногистостейнере ThermoScentific с использованием МКА к p16 (cloneINK4 BioGenex в разведении 1:25) и р53 (cloneAb-5 (DO-7) LabVision в разведении 1:100). Визуализацию реакции осуществляли системой детекции Ultra Vision Qanto Detection System HRPDAB («ThermoScentific»). Применен балльный критерий степени экспрессии p16INK4A: 0 (нет окрашивания), 1 (окрашено 1—10% опухолевых клеток), 2 (11—40%), 3 (41—70%) и 4 (более 71%) (рис. 1, а—г)

Рис. 1. Экспрессия p16INK4А. а — экспрессия р16 1 балл (0—10% окрашенных клеток); б — экспрессия р16 2 балла (11—40% окрашенных клеток); в — экспрессия р16 3 балла (41—70% окрашенных клеток); г — экспрессия р16 4 балла (71% окрашенных клеток и более).
[6]. Гиперэкспрессию p16INK4A устанавливали при 3 и 4 баллах окрашивания (ядерное и/или цитоплазматическое окрашивание 40% клеток и более). Иммуногистохимическое окрашивание р53 характеризовалось по степени ядерного окрашивания: 0 — отрицательно, менее 25% опухолевых клеток — 1+, 25—50% опухолевых клеток — 2+, 50—100% опухолевых клеток — 3+. Гиперэкспрессию р53 устанавливали при наличии реакции 3+ (рис. 2, а,
Рис. 2. Экспрессия р53 3+. а — гиперэкспрессия р53 (51—100% окрашенных клеток); б — отрицательная экспрессия р53 (0—25% окрашенных клеток).
б).

Статистический анализ данных

Статистический анализ выполнен с использованием статистического пакета IBMSPSS Statistics version 22. Для характеристики количественных данных использовали описательный метод расчета средних величин, статистических ошибок, для их сравнения — t-критерий Стьюдента. Для оценки достоверности различий клинико-морфологических характеристик в подгруппах в зависимости от степени экспреcсии р16INK4A использовали метод распределения χ2 по Пирсону, в случаях, предусмотренных статистическими методами, индекс рассчитывали с поправкой Йетса. Значение p≤0,05 оценивали как статистически достоверное. Для оценки общей выживаемости в зависимости от молекулярных детерминант использовали метод Каплана—Майера, достоверность различий определяли по логарифмическому ранговому критерию. Значение p≤0,05 оценивали как статистически достоверное.

Результаты

При анализе медицинской документации 55 больных ОФПКК и раком тела языка распределение по стадиям по классификации TNM 7-го пересмотра было следующим: I—II стадия выявлена у 15 (20%) из 55 больных, а III—IV стадия — у 40 (80)% из 55 пациентов. Только хирургический метод лечения получили 5 (9%) из 55 человек. Оперативному лечению с последующим облучением были подвергнуты 11 (20%) из 55 пациентов. Лучевую терапию получили 10 (15)% из 55, неоадъювантную химиотерапию с последующим облучением — 14 (25%) из 55 человек. Остальным 15 (28%) из 55 больных назначали только полихимиотерапию.

Из исследованных гистологических блоков гиперэкспрессия белка р53 (3+, р53≥50%) выявлена у 33 (60%) пациентов. Из них I—II стадия отмечена у 10 (30%) из 33 человек, III—IV стадия — у 25 (70%). Отрицательная экспрессия р53 (0—25%) выявлена у 13 (24%), слабая экспрессия (26—50%) — у 9 (16%) пациентов. У пациентов с отрицательной и слабой экспрессией р53 I—II стадия заболевания отмечена у 5 человек, III—IV стадия — у 15.

Экспрессия р16INK4A 40—70% (3 балла) обнаружена у 9 пациентов. Из них гиперэкспрессия р53 (р53≥50%) выявлена у 5 (56%) пациентов, экспрессия р53<50% наблюдалась у 4 (44%). Гиперэкспрессию р16≥70% (3 балла) имели 6 пациентов. Из них гиперэкспрессия р53≥50% отмечена у 4 (67%) пациентов, а отсутствие или слабая экспрессия р53 (р53≤50%) — у 2 (33%). В исследованной группе больных при иммуногистохимическом исследовании гиперэкспрессия р16INK4A (3 и 4 балла) выявлена у 15 (27%) из 55 пациентов. При этом в группе р16-позитивных человек I—II стадия отмечена у 3 (20%) из 15 больных, III—IV стадия — у 2 (80%) из 15. Из них гиперэкспрессия р53 (3+) присутствовала в опухоли 8 (53%) пациентов. Слабая экспрессия или ее отсутствие отмечены у 7 (47%) пациентов. Окрашивание р16INK4A 1 и 2 балла (менее 40% опухолевых клеток) установлено у 40 (73%) пациентов. Из них р53≥50% имели 24 (60%) пациента, р53<50% — 16 (40%) пациентов.

Выявлено, что демографические, клинические, морфологические характеристики различны в зависимости от паттерна экспрессии p16INK4A. Возраст больных в исследуемой группе составил от 36 до 82 лет (µ=56,45, σ=9,888, Ме=58, SD=1,333). При гиперэкспрессии p16INK4A (3 и 4 балла) возраст больных ПРГШ (n=15) составил от 39 до 68 лет (µ=53,4, σ=9,731, Ме=57, SD=2,512). Возраст 40 р16-негативных пациентов (при экспрессии p16INK4A <40%) составил от 36 до 82 лет (µ=57,6, σ=9,21, Ме=57, SD=1,553). При сравнении средних показателей возраста в двух группах t-критерий Стьюдента 1,42. Число степеней свободы f=53, p=0,160956. Различие показателей статистически незначимо. Половое распределение в исследуемых группах: из 15 больных с р16-позитивным статусом опухоли были 9 (60%) мужчин и 6 (40%) женщин. При р16-негативном статусе из 40 человек мужчин 35 (87,5%) и 5 (12,5%) женщин. ВПЧ-позитивный статус опухоли был статистически достоверно чаще ассоциирован с женским полом (р=0,023) (табл. 1).

Таблица 1. Связь паттерна экспрессии p16INK4A и р53 с полом и возрастом больных ПРГШ Примечание. Здесь и в табл. 2 и 3: * — различия статистически значимы.

При рассмотрении локализации рака ротоглотки p16INK4A-позитивный статус характерен для рака небных миндалин (р<0,001). Связь рака ротоглотки других отделов (корень языка, мягкое небо, боковые стенки ротоглотки) с p16INK4A-статусом опухоли достоверно не подтверждена, но имеется тенденция взаимосвязи рака тела языка с низкой экспрессией p16INK4A (р=0,061) (табл. 2).

Таблица 2. Связь паттерна экспрессии p16INK4A и р53 с локализацией ПРГШ

Степень дифференцировки опухоли не зависела от p16INK4A-статуса опухоли (р=0,927). Р16-негативные образцы опухоли были ороговевающими или имели склонность к ороговению. Р16-позитивный рак был представлен неороговевающим типом (р=0,008). Гиперэкспрессия р53 статистически значимо коррелировала с умеренной степенью дифференцировки опухоли (р=0,021), а экспрессия р53<50% была характерна для рака тела языка (р=0,004). Высокий индекс пролиферативной активности (Ki-67≥60) также характерен для р16-позитивного рака, что отражает особенности патогенеза этого типа рака (р=0,02). Экспрессия р16 достоверно не влияет на размер первичной опухоли (Т), но выявлена взаимосвязь с более частым метастазированием в регионарные лимфатические узлы при гиперэкспрессии p16INK4A (р=0,029). По показателям общей 3-летней выживаемости в группе р16-позитивных пациентов имелось статистически значимое преимущество (р=0,016) (табл. 3).

Таблица 3. Связь паттерна экспрессии p16INK4A и р53 с Ki-67, распространенностью опухоли и 3-летней выживаемостью

В исследовании выявлена зависимость клинико-морфологических параметров от комплекса уровня экспрессии р16≥40% и р53≥50%. Эта комбинация молекулярных признаков встречалась у 9 пациентов из исследованной когорты, у 46 она отсутствовала. При ее наличии различий в отношении пола не выявлено, однако она отсутствовала у 40 мужчин и всего у 6 женщин (χ2=4,989; р=0,026). Связь с морфологией опухоли – ороговение и степень злокачественности — не выявлена (р=0,110 и р=0,977 соответственно). Наиболее часто комплекс маркеров встречался при раке небных миндалин (χ2=9,875; р=0,046), что статистически значимо. Имела место тенденция к статистической значимости корреляции комплекса экспрессии р16≥40% и р53≥50% и индекса пролиферативной активности Ki-67≥60% (χ2=3,341; р=0,068).

Влияние молекулярных маркеров на общую выживаемость больных ПРГШ

Больные с гиперэкспрессией p16INK4A (3 и 4 балла) в среднем живут дольше, чем p16INK4A-негативные. Средняя продолжительность жизни при р16-позитивности 42,702 мес, σ=5,989, Ме=60, SD=22,591; при р16-негативности µ=25,882 мес, σ=3,852, Ме=20, SD=3,039. Общая выживаемость в зависимости от экспрессии p16INK4A в подгруппах с гиперэкспрессией и без гиперэкспрессии оценена методом Каплана–Майера. При использовании логарифмического рангового критерия общая выживаемость больных p16INK4A-позитивным ПРГШ достоверно выше, чем p16INK4A-негативных пациентов без учета стадии заболевания (р=0,048).Средняя продолжительность жизни у больных III—IV стадии при р16-позитивности 43,091 мес, σ=6,718, Ме=60, SD=24,638; при р16-негативности µ=24,122 мес, σ=4,607, Ме=16, SD=5,714. Показатели общей выживаемости больных p16-позитивным ПРГШ достоверно выше, чем p16INK4A-негативных пациентов при III—IV стадии (р=0,021) (рис. 3).

Рис. 3. Показатели общей выживаемости в зависимости от степени экспрессии p16INK4A при III—IV стадии.
При I—II стадии преимуществ в выживаемости р16-позитивных пациентов не получено (р=0,583). Общая выживаемость при выявлении экспрессии р53 не имела различий по паттерну экспрессии при оценке методом Каплана—Майера. При использовании логарифмического рангового критерия статистически достоверных различий в общей выживаемости не отмечено (р=0,0986).Больные с коэкспрессией p16INK4A (3 и 4 балла) и р53 (3+) в среднем живут дольше, чем при отсутствии этого признака. Средняя продолжительность жизни у больных при наличии комбинированного маркера 48,429 мес, σ=8,670. При р16-негативности µ=27,265 мес, σ=3,500.

Общая выживаемость в зависимости от признака коэкспрессии p16INK4A (3 и 4 балла) и р53 (3+) оценена методом Каплана—Майера. При использовании логарифмического рангового критерия общая 3-летняя выживаемость больных ПРГШ с коэкспрессией p16INK4A (3 и 4 балла) и р53 (3+) достоверно выше, чем в отсутствие сочетания этих молекулярных маркеров вне зависимости от стадии заболевания (р=0,049). При этом общая выживаемость больных ПРГШ и коэкспрессией p16INK4A (3 и 4 балла), р53 (3+) достоверно выше, чем в отсутствие сочетания этих молекулярных маркеров для III—IV стадии (р=0,01) (рис. 4).

Рис. 4. Показатели общей выживаемости в зависимости от коэкспрессии p16INK4A (3 и 4 балла) и р53 (3+) при III—IV стадии.
Для больных с коэкспрессией p16INK4A (3 и 4 балла), р53 (3+) общая выживаемость при I—II стадии достоверно не отличается от таковой в отсутствие сочетания этих молекулярных маркеров (р=0,960).

Заключение

Полученные результаты характеризуют значимую корреляцию паттерна окрашивания р16INK4A с клинико-морфологическими особенностями опухолей ПРГШ. Таким образом, при гиперэкспрессии р16INK4A (3 и 4 балла), что, согласно данным литературы, связано с ВПЧ-позитивностью опухоли, наиболее часто и статистически значимо встречается рак небных миндалин. Опубликованные данные литературы свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия р53 при ПРГШ коррелирует с неблагоприятным прогнозом по показателям выживаемости. В данном исследовании полученные результаты не указывают на худший прогноз в отношении общей выживаемости у больных ПРГШ с гиперэкспрессией р53, более того, при комбинции экспрессии с другими молекулярными маркерами могут прогнозировать благоприятные исходы. Гиперэкспрессия р16INK4A статистически значимо связана с более высокими показателями общей выживаемости. Данные представленного исследования описывают также статистически значимую взаимосвязь комплекса уровней экспрессии р16INK4A, р53 с показателями общей выживаемости. При этом можно выделить прогностически благоприятную группу больных ПРГШ в исследованной когорте по паттерну окрашивания при сочетании уровня экспрессии р16 ≥40% (3,4 балла) и р53≥50% (3+), что отражено в более высоких показателях общей 3-летней выживаемости в сравнении с другими вариантами коэкспрессии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.И.С., В.Н.Б.

Сбор и обработка материала — А.И.С., О.Ю.Ч., В.А.П

Статистическая обработка данных — А.И.С.

Написание текста — А.И.С.

Редактирование — А.И.С., В.Н.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Стукань А.И. — e-mail: jolie86@bk.ru; https://orcid.org/0000-0002-0698-7710

Чухрай О.Ю. — e-mail: kkod@kkod.ru

Бодня В.Н. — e-mail: vadimbodnya@rambler.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail