Федорова Н.С.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России, Москва, Россия

Абросимов А.Ю.

ФГУ Эндокринологический научный центр, Москва

Дзеранова Л.К.

Эндокринологический научный центр Минздрава РФ, Москва

Пигарова Е.А.

ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, Москва

Дедов И.И.

Лактотрофные аденомы гипофиза, резистентные к лечению агонистами дофамина: гистологическая и иммуногистохимическая характеристика

Журнал: Архив патологии. 2018;80(3): 34-39

Просмотров : 279

Загрузок : 4

Как цитировать

Федорова Н. С., Абросимов А. Ю., Дзеранова Л. К., Пигарова Е. А., Дедов И. И. Лактотрофные аденомы гипофиза, резистентные к лечению агонистами дофамина: гистологическая и иммуногистохимическая характеристика. Архив патологии. 2018;80(3):34-39.
Fedorova N S, Abrosimov A Iu, Dzeranova L K, Pigarova E A, Dedov I I. Pituitary lactotroph adenomas resistant to dopamine agonist treatment: histological and immunohistochemical characteristics. Arkhiv Patologii. 2018;80(3):34-39.
https://doi.org/10.17116/patol201880334-39

Авторы:

Федорова Н.С.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России, Москва, Россия

Все авторы (5)

Лактотрофные аденомы гипофиза — ЛАГ (синонимы: пролактинсекретирующие аденомы, пролактиномы) наиболее распространены среди гормонально активных опухолей и составляют около 40% всех новообразований аденогипофиза [1, 2]]. До 80% пролактином представляют собой микроаденомы диаметром менее 1 см [3]. В настоящее время основным методом лечения пролактином является терапия агонистами дофамина. В результате медикаментозного лечения данной группой препаратов в большинстве случаев отмечаются нормализация уровня пролактина (ПРЛ) в крови и регрессия опухоли [4]. Однако механизм влияния медикаментов на опухолевую ткань in vivo недостаточно изучен. Известно, что агонисты дофамина вызывают биологический эффект, связываясь с дофаминовыми рецепторами 2-го типа (ДР2) опухолевых клеток. Полагают [5], что резистентность больных к терапии агонистами дофамина обусловлена низкой экспрессией ДР2. Известна статистическая значимость индекса пролиферации Ki-67 как маркера агрессивного роста аденом гипофиза [6]. В литературе [7] имеются сведения о наличии в тканях ЛАГ эстрогеновых рецепторов. Встречаются единичные работы, в которых приводятся данные о применении препаратов из групп аналогов соматостатина [8], селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов [9], темозоломида [10]. Современные методы консервативного и хирургического лечения больных с ЛАГ требуют теоретического обоснования. Поэтому представляет интерес изучение иммуногистохимических особенностей ПРЛ, резистентных к лечению агонистами дофамина, и в частности экспрессии ДР2, эстрогеновых рецепторов, маркеров пролиферации и ангиогенеза.

Цель исследования — анализ гистологической и иммуногистохимической характеристики ЛАГ, резистентных к лечению агонистами дофамина.

Материал и методы

В исследование включили 19 пациентов (13 женщин и 6 мужчин) с пролактиномами, резистентными к лечению агонистами дофамина. Резистентность к терапии агонистами дофамина оценивали как отсутствие нормализации уровня ПРЛ в сыворотке крови и/или уменьшения размера аденомы на 50% у пациентов, получавших лечение каберголином в недельной дозе 3 мг и более в течение не менее 6 мес.

По результатам магнитно-резонансной томографии (МРТ) и с использованием представленной далее классификации J. Hardy все опухоли были разделены на инвазивные и неинвазивные. Неинвазивным аденомам соответствовали степени 1 и 2А, инвазивным — степени 3 и 4 (А—Е).

Классификация аденом гипофиза по J. Hardy:

Степень 1 — эндоселлярная микроаденома;

Степень 2 — эндоселлярная макроаденома, полностью заполняющая полость турецкого седла;

Степень 3 — макроаденома с локальной деструкцией дна турецкого седла;

Степень 4 — макроаденома с тотальным разрушением турецкого седла.

Подразделение по группам при параселлярном росте аденомы:

D — интракраниальное (интрадуральное);

E — латеральное распространение в кавернозный синус.

Морфологический анализ операционного материала включал гистологический и иммуногистохимический (ИГХ) методы исследования. Гистологическое исследование проведено по стандартной схеме с окрашиванием гематоксилином и эозином. Срезы для ИГХ-исследования были нанесены на стекла с адгезивным покрытием, депарафинированы, выдержаны в 3% растворе перекиси водорода в течение 10 мин для подавления активности эндогенной пероксидазы, затем термически обработаны в цитратном буфере (pH 6,0) в микроволновой печи в течение 15 мин для восстановления антигенов опухолевой ткани. Далее срезы промывали в дистиллированной воде и фосфатном буфере, после чего на них наносили первичные антитела к ПРЛ, соматотропному (СТГ), тиреотропному (ТТГ), лютеинизирующему (ЛГ), фолликуло-стимулирующему (ФСГ), адренокортикотропному (АКТГ) гормонам, ДР2, эстрогеновому рецептору-α (ЭРα), маркеру клеточной пролиферации Ki-67, маркеру ангиогенеза CD34. Инкубация с первичными антителами составила 40 мин при температуре 37 °C. После отмывания в фосфатном буфере на срезы наносили вторичные антитела к кроличьим и мышиным иммуноглобулинам, связанные с системой визуализации, не содержащей биотин, на 30 мин при температуре 37 °C. После отмывания вторичных антител в фосфатном буфере срезы окрашивали диаминобензидином в течение 5 мин. На последнем этапе проводили окрашивание клеточных ядер гематоксилином, затем обезвоживали срезы и заключали их в синтетическую среду.

Иммуноэкспрессия тропных гормонов была оценена в цитоплазме опухолевых клеток, ДР2 — в цитоплазме и на мембране опухолевых клеток, Ki-67, ЭРα — в ядрах клеток аденом, CD34 — в цитоплазме эндотелиальных клеток сосудов опухолей. Участки некроза, выраженного фиброза, кровоизлияния, гиперплазии аденогипофиза были исключены из анализа. Иммуногистологическую реакцию на СТГ считали положительной при окрашивании более 50% опухолевых клеток, на ПРЛ — более 30%. Такой метод оценки выбран для исключения ложноположительных результатов, связанных с возможным попаданием клеток аденогипофиза во время транссфеноидальной аденомэктомии в исследуемый материал. Проценты отражают долю, которую составляют соматотрофы и лактотрофы от всех клеток нормального гипофиза [11]. Иммуноэкспрессию ДР2 считали положительной при окраске более 30% опухолевых клеток в 10 полях зрения при 40-кратном увеличении микроскопа. Иммуноэкспрессия ЭРα оценена полуколичественным методом по формуле a+b, где a — количество окрашенных клеток: 0 — отсутствие окраски, 1 балл — единичные клетки, 2 балла — до 1/10 всех клеток, 3 балла — 1/10—1/3 клеток, 4 балла — 1/3—2/3 клеток, 5 баллов — более 2/3 клеток; b — интенсивность окрашивания, выраженная в баллах: 0 баллов — реакция отсутствует, 1 балл — слабая, 2 балла — умеренная, 3 балла — выраженная. При сумме баллов 3 и более результат окрашивания считали положительным. Значение индекса пролиферации Ki-67 вычисляли как среднее число положительно окрашенных ядер в поле зрения микроскопа (×40)при исследовании не менее 5 полей зрения. Количество сосудов опухоли определяли, подсчитав среднее число сосудов в препаратах, окрашенных на CD34, в 5 полях зрения при 40-кратном увеличении микроскопа.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2010, Statistica for Windows v.10. Количественные данные приведены в виде медианы и квартилей — Me (Q25;Q75), качественные признаки — в виде долей. Сравнительный анализ независимых групп по количественному признаку проведен с использованием критерия Манна—Уитни, по качественному признаку — с использованием двустороннего точного критерия Фишера. Взаимосвязь изучаемых признаков определена с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Клиническая характеристика пациентов приведена в таблице.

Клиническая характеристика пациентов Примечание. * — Me (Q25; Q75); ** — по классификации J. Hardy. ПРЛ — пролактин.
Все пациенты на первом этапе лечения получали каберголин в дозе 3—6 мг/нед. В отсутствие нормализации уровня ПРЛ в сыворотке крови на фоне медикаментозного лечения пациентам выполнена аденомэктомия.

Диагноз аденомы гипофиза во всех случаях подтвержден результатами гистологического исследования. Участки фиброза выявлены в 2 (10,5%) аденомах, отек стромы наблюдали в 2 (10,5%). Единичные митозы найдены в 5 (26%) опухолях, полиморфизм ядер — в 5 (26%) наблюдениях. Псаммомные тельца обнаружены в опухолях у 5 (26%) больных.

При ИГХ-исследовании у всех пациентов подтвержден диагноз ЛАГ на основании положительной иммуноэкспрессии ПРЛ (см. рисунок,

Иммуногистохимическая характеристика лактотрофных аденом гипофиза, резистентных к лечению агонистами дофамина. Иммуноэкспрессия: а — пролактина в опухолевых клетках; б — соматотропного гормона в опухолевых клетках; в — дофаминовых рецепторов 2-го типа в опухолевых клетках; г — эстрогеновых рецепторов α в опухолевых клетках; д — Ki-67 в ядрах опухолевых клеток; е — CD34 в эндотелии сосудов опухоли; а—е х400.
а). Сочетанная иммуноэкспрессия ПРЛ и СТГ выявлена у 3 (16%) пациентов, хотя клинически подозрений на наличие у них акромегалии не возникало и уровень СТГ в крови составлял 0,1—0,3 нг/мл (см. рисунок, б). Ни в одном наблюдении не выявлено экспрессии ТТГ, АКТГ, ЛГ, ФСГ.

Положительная иммунореакция с антителами к ДР2 обнаружена в 8 (42%) случаях (см. рисунок, в), ЭРα — в 6 (32%) (см. рисунок, г). У 6 (32%) пациентов не выявлено экспрессии ни одного из исследованных клеточных рецепторов. При сравнительном анализе данных у пациентов с положительной и отрицательной иммунореакцией на ДР2 не найдено различий по таким клиническим характеристикам, как пол, возраст, длительность заболевания, объем опухоли и характер ее распространения, уровень ПРЛ в крови, доза каберголина.

В нашем исследовании ЛАГ характеризовались низкой пролиферативной активностью. Маркер опухолевой пролиферации Ki-67 у 12 (63%) из 19 случаев имел нулевые значения, у 7 (37%) из 19 случаев варьировал от 1 до 8% — 0 (0; 1), причем у 3 (16%) он составил более 3% (см. рисунок, д). Уровень Ki-67 был статистически значимо выше у пациентов с супраселлярным (p=0,047) или ретроселлярным (р=0,022) распространением опухоли. Найдена положительная корреляция между уровнями Ki-67 и ПРЛ в крови в дебюте заболевания (r=0,59; p=0,008). При этом не обнаружена зависимость между иммуноэкспрессией Ki-67 и полом, возрастом больных, длительностью заболевания, объемом аденомы и инвазивным ростом опухоли, а также связи между иммуноэкспрессией Ki-67 и такими гистологическими характеристиками, как наличие митозов, полиморфизм ядер, количество сосудов.

С целью оценки ангиогенеза аденомы мы провели исследование с помощью антител к маркеру сосудистого эндотелия CD34 (см. рисунок, е). Медиана количества сосудов составила 37 (25, 85). Выявлено, что у пациентов с параселлярным распространением опухоли, по данным МРТ, количество сосудов в аденоме больше, чем у больных без параселлярного роста аденомы — 85 (44; 97) против 32 (22; 38); р=0,001, а также при наличии инвазии в кавернозные синусы количество сосудов статистически значимо больше — 76 (44; 93) против 32 (24; 47); р=0,04). В нашем исследовании не выявлено зависимости иммуноэкспрессии CD34 от пола, возраста больных, длительности заболевания, размера опухоли, предоперационного уровня ПРЛ, наличия митозов, полиморфизма ядер клеток аденомы, уровня Ki-67.

Обсуждение

Сочетанная иммуноэкспрессия ПРЛ и СТГ без клинико-лабораторных проявлений акромегалии встречается в ЛАГ [12]. Возможно, это связано с общей клеткой-предшественницей, из которой в присутствии эстрогенов происходит развитие лактотрофной клетки, а в отсутствие эстрогенов по умолчанию формируется соматотрофная клетка.

I. Pellegrini и соавт. [5] и A. Gurlek и соавт. [6] полагают, что основной причиной развития резистентности является отсутствие ДР2 на мембране лактотрофов. Однако результаты настоящего исследования не могут полностью подтвердить эту теорию: ДР2 присутствовали в 42% наблюдений. Кроме того, в исследовании S. Shimazu и соавт. [13] показано, что при ИГХ-исследованиии показатели иммуноэкспрессии ДР2 статистически значимо не различались у пациентов с разной степенью ответа на медикаментозное лечение агонистами дофамина. В том же исследовании авторы, определив уровень мРНК ДР2, обнаружили, что он ниже у резистентных, чем у чувствительных к терапии агонистами дофамина, пациентов. Таким образом, показано несоответствие результатов двух методов исследования ДР2, что находит подтверждение и в других работах. L. Stefaneanu и соавт. [14] провели параллельно определение экспрессии ДР2 при ИГХ-исследовании ткани аденомы и определение мРНК и показали, что лечение бромокриптином сопровождалось увеличением уровня мРНК ДР2 при отрицательной иммуногистологической реакции; это указывает на стабильность мРНК. Аналогичные данные были получены при наблюдении больного с питуитарной карциномой, резистентной к агонистам дофамина, с внутри- и экстракраниальными метастазами. Наличие мРНК ДР2 и белка ДР2 изучали иммуногистологическим методом: мРНК ДР2 была обнаружена в первичных опухолевых и метастатических тканях, тогда как белок ДР2 выявлялся только в хирургически удаленной первичной опухоли гипофиза, но не в метастазах [15]. Авторы продемонстрировали отсутствие белка ДР2 при ИГХ-исследовании, несмотря на сохранение транскрипта на поздней стадии злокачественной ЛАГ. Результаты работ [13—15] позволяют предположить, что механизмы посттранскрипции могут способствовать развитию резистентности к агонистам дофамина.

Эстрогеновые рецепторы обнаружены во многих тканях, в том числе в аденогипофизе [16]. В нашем исследовании резистентные к агонистам дофамина опухоли экспрессировали ЭРα в 1/3 случаев. Аналогичный показатель у G. Kaptain и соавт. [17] составляет 72%, однако они не учитывали степень ответа на лечение агонистами дофамина, кроме того, в описании работы не указан тип исследованных эстрогеновых рецепторов — α или β.

В. Manoranjan и соавт. [18] при проведении ИГХ-исследовании у 75 пациентов с аденомами гипофиза выявили значительное преобладание повышенной экспрессии ЭРα в макроаденомах по сравнению с микроаденомами и в неинвазивных аденомах по сравнению с инвазивными опухолями. E. Delgrange и соавт. [19], показали, что низкая экспрессия ЭРα ассоциируется с инвазивным ростом ЛАГ и резистентностью к лечению агонистами дофамина, и предлагают рассматривать отсутствие экспрессии ЭРα как вероятный показатель неблагоприятного прогноза.

Изучив резистентные к агонистам дофамина ЛАГ, мы не обнаружили связи между иммуноэкспрессией ЭРα и инвазивным ростом аденомы, по данным МРТ. Анализ различий иммуноэкспрессии у пациентов с микро- и макроаденомами не проводили, так как в 95% случаев пациенты, которым выполнено ИГХ-исследование, имели макроаденомы.

Пролиферативная активность клеток в настоящем исследовании определена с помощью индекса пролиферации Ki-67, который считается наиболее достоверным показателем клеточной пролиферации в аденомах гипофиза. Сравнительное исследование E. Delgrange и соавт. [20] показало более высокий индекс пролиферации Ki-67 у резистентных к агонистам дофамина пациентов по сравнению с чувствительными. Мы не проводили такой анализ, однако выявили положительную корреляцию между уровнем Ki-67 и уровнем ПРЛ в сыворотке крови в дебюте заболевания. Более высокий уровень ПРЛ у пациентов с резистентностью к агонистам дофамина [21] косвенно отражает тот факт, что индекс пролиферации Ki-67 выше в резистентных ЛАГ по сравнению с чувствительными.

Согласно данным литературы [22], не существует единого определения агрессивности аденом гипофиза. В клинической картине пролактином наиболее важными факторами являются резистентность к агонистам дофамина и высокая частота рецидивов после операции. Радиологическим признаком агрессивности аденом считается наличие инвазивного роста опухоли в смежные структуры, такие как кавернозный синус. В основе разрастания и инвазии опухоли лежит увеличение пролиферации клеток, митотической активности, клеточной адгезии. Известна статистическая значимость индекса пролиферации Ki-67 как маркера агрессивного роста аденом гипофиза [6]. Нами не найдено связи между уровнем Ki-67 и наличием инвазивного роста (по данным МРТ) аденомы, однако уровень Ki-67 был выше у пациентов с супра- или ретроселлярным ростом аденомы. Наши результаты согласуются с результатами других исследований, в которых также не обнаружено существенной разницы индекса пролиферации Ki-67 в зависимости от распространения опухоли, по данным МРТ [23], а также от размера аденомы [24].

В настоящем исследовании показана связь между маркером ангиогенеза и клиническими признаками агрессивного поведения ЛАГ: количество сосудов, оцененное с помощью CD34, оказалось статистически значимо больше в опухолях с параселлярным ростом, а также при распространении аденомы в кавернозные синусы, при которых хирургическое лечение часто не достигает успеха. Мы не обнаружили зависимости между иммуноэкспрессией маркеров ангиогенеза и показателем пролиферации, измеренным с помощью антител к Ki-67, что подтверждается данными других исследований [25].

Вывод

Лактотрофные аденомы гипофиза, резистентные к агонистам дофамина, могут экспрессировать соматотропный гормон, характеризуются умеренной иммуноэкспрессией дофаминовых рецепторов 2-го типа и эстрогеновых рецепторов α, низкой пролиферативной активностью, повышенным ангиогенезом в аденомах с параселлярным ростом и инвазией в кавернозные синусы. Выявление в ткани аденомы эстрагеновых рецепторов α открывает новые возможности для консервативного лечения резистентных к агонистам дофамина лактотрофных аденом гипофиза.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Ю.А., Л.К.Д., И.И.Д.

Сбор и обработка материала — Н.С.Ф., Л.К.Д.

Статистическая обработка — Н.С.Ф., Е.А.П.

Написание текста — Н.С.Ф.

Редактирование — А.Ю.А., Л.К.Д., Е.А.П., И.И.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Федорова Наталья Сергеевна — асп. отд. нейроэндокринологии и остеопатий; e-mail: fedorova.n.s.12@gmail.com; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9816-5043

Абросимов А.Ю.https://orcid.org/0000-0001-8284-9996

Дзеранова Л.К.https://orcid.org/0000-0002-0327-4619

Пигарова Е.К.https://orcid.org / 0000-0001-6539-466X

Дедов И.И.https://orcid.org /0000-0002-8175-7886

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail