В структуре всех злокачественных опухолей щитовидной железы папиллярный рак (ПРЩЖ) в разных странах мира составляет от 65 до 93% [1]. В большинстве случаев ПРЩЖ развивается относительно медленно, хорошо поддается лечению и отличается благоприятным прогнозом. Однако, по данным разных авторов [2—4], в отдаленные сроки послеоперационного периода (наблюдение до 30 лет) у 8—30% пациентов отмечено развитие местного рецидива и прогрессирование опухоли. Для оценки риска неблагоприятного исхода заболевания и индивидуальной коррекции тактики лечения, включая таргетную терапию, предложены различные маркеры прогноза [5, 6], в том числе и молекулярно-генетические [7].
Активирующие мутации BRAFT1699A (BRAFV600E) служат диагностическим онкомаркером ПРЩЖ, так как они патогномоничны для этого гистологического типа и играют немаловажную роль в развитии и прогрессировании опухоли [8]. Значение мутаций BRAFV600E как показателя прогноза и агрессивных биологических свойств опухолевого роста пока еще не нашло однозначного толкования [9, 10]. Отчасти это связано и с тем, что молекулярно-генетические технологии оценки статуса BRAFV600E не являются доступными для большинства российских патолого-анатомических подразделений. Напротив, иммуногистохимические исследования уже прочно вошли в повседневную диагностическую практику патологоанатомов, а данные литературы [11—13] свидетельствуют о достаточно высокой корреляции результатов оценки статуса BRAFV600E иммуногистохимическим и молекулярными методами. Под молекулярно-генетическими методами понимают не только секвенирование по Сэнгеру, но и ряд других методов, например, аллельспецифичная полимеразная цепная реакция (ПЦР), различные варианты количественной ПЦР в реальном времени, метод удлинения праймера (SNaPshot), секвенирование нового поколения и др. Следует сказать, что каждый из методов имеет преимущества и недостатки. При использовании молекулярных методов можно обходиться минимальным количеством материала, однако они чувствительны к соотношению опухолевых эпителиальных клеток и неэпителиального компонента, а также к качеству материала. Результаты молекулярного исследования фиксированной в формалине и свежезамороженной ткани могут отличаться. Иммуногистохимический метод также может давать варьирующие результаты в зависимости, например, от длительности фиксации ткани в формалине, и способов демаскирования антигена.
В настоящем исследовании мы провели анализ иммуноэкспрессии мутантного BRAF в серии ПРЩЖ и исследовали связь мутаций с клиническими и морфологическими особенностями опухолей с учетом отдаленных результатов лечения.
Материал и методы
В исследование включены 74 пациента (18 мужского и 56 женского пола), получивших лечение по поводу ПРЩЖ в клинике Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба (МРНЦ) — филиал ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России за 15-летний период (с 1999 по 2013 г.). Проанализированы полученная из базы данных клиническая и морфологическая информация, а также данные об отдаленных результатах лечения, основанные на наблюдении за пациентами в послеоперационном периоде в сроки от 0,1 года до 18 лет. Из всего массива базы данных отобраны 33 случая ПРЩЖ с установленным рецидивом опухолевого роста и 41 случай ПРЩЖ у пациентов соответствующего пола, возраста и стадии опухолевого роста, но без указания на рецидив. Опухоль считали рецидивирующей, если заболевание выявлено не ранее, чем через 0,6 года после первичного лечения. Возраст пациентов на момент первого хирургического вмешательства варьировал от 9 до 80 лет.
Репрезентативные парафиновые блоки первичных, рецидивных и метастатических опухолей отобраны из архива патолого-анатомического отделения МРНЦ. Блоки исследованы после микротомии с получением гистологических срезов толщиной 4 мкм с окраской гематоксилином и эозином и использованием иммуногистохимических реакций с первичными антителами к белковому продукту мутантного BRAF. Протокол иммуногистохимического исследования включал депарафинирование и регидратацию срезов с последующим промыванием, демаскирующей обработкой (автоклавирование при 120 °C в течение 20 мин в буфере CC1 производства «Ventana Medical Systems»), блокированием неспецифической окраски и эндогенной пероксидазной активности и инкубацией во влажной камере с мышиными моноклональными антителами anti-BRAF V600E (VE1) от Spring Bioscience (E19290) в разведении 1:100 в течение 1 ч при температуре 37 °C. Для детекции продукта иммуногистохимической реакции использовали систему визуализации Novolink Polymer Detection System (250T) Leica (RE7140-K), включая инкубацию в течение 30 мин, последующее присоединение пероксидазной метки и проявление с помощью хромогена DAB, растворенного в субстратном буфере Novolink DAB Substrate Buffer. Ядра клеток докрашивали гематоксилином. Срезы обезвоживали в серии восходящей концентрации спиртов, просветляли ксилолом и заключали в синтетическую полимерную среду. Результаты иммуногистохимической реакции оценивали 3 патологоанатома и считали положительными в случае установления интенсивного коричневого окрашивания цитоплазмы эпителиальных опухолевых клеток. Положительным контролем служил гистологический срез ПРЩЖ с ранее выявленной методом прямого секвенирования мутацией BRAFV600E. Статистический анализ выполнен в пакете статистических программ SPSS (версия 21) с вычислением средней арифметической величины ±SD для количественных и процента для качественных признаков. Однофакторный анализ, включая точный тест Фишера, для частотных показателей и непараметрический тест Манна—Уитни для количественных признаков, проведен для установления связи различных клинико-морфологических параметров со статусом BRAF.
Многофакторный регрессионный анализ (модель пропорциональных рисков Кокса) выполнен для установления прогностической значимости различных клинико-морфологических особенностей. Для уточнения прогностической значимости статуса BRAF на фоне других потенциальных факторов проведен многофакторный регрессионный анализ с пошаговым исключением переменных (оптимизированная модель). Различия считали статистически значимыми при р≤0,05.
Результаты и обсуждение
Иммуноэкспрессия BRAF обнаружена в ПРЩЖ 29 пациентов (BRAF+, 39,2%), в остальных 45 случаях она отсутствовала (BRAF–). Примеры иммуногистохимической визуализации BRAF представлены на рис. 1.
Следует заметить, что в подавляющем большинстве случаев BRAF-статус совпадал у первичных, метастатических и рецидивных опухолей (коэффициент корреляции для всех доступных пар 0,865; р<0,0001). Результаты исследования первичных и метастатических тканей выявили, что совпадение статуса BRAF наблюдалось в 17 (89,5%) из 19 случаев в группе BRAF+ и в 26 (96,3%) из 27 случаев в группе BRAF–. Исключение в соответствии статуса BRAF в первичных и метастатических или рецидивных опухолях составили 3 наблюдения: в 2 случаях первичного ПРЩЖ установлен статус BRAF+, а в соответствующих метастатического — BRAF–; в 1 случае первичного ПРЩЖ зарегистрирован статус BRAF–, а в соответствующем метастатического ПРЩЖ — BRAF+.
Результаты анализа средней безрецидивной выживаемости пациентов показали значимые различия (р=0,019) между двумя сравниваемыми группами BRAF– и BRAF+, которые составляли 12,2 и 7,1 года с 95% доверительными интервалами 9,7—14,6 и 4,3—9,9 года соответственно. Средняя арифметическая величина продолжительности наблюдения в 1-й группе составила 8,1 года (интервал от 0,1 года до 18 лет), а во 2-й — 4,9 года (колебания от 0,1 года до 18 лет), различия не являются статистически значимыми (р=0,205). Графически показатели безрецидивной выживаемости пациентов в группах с различным BRAF– статусом представлены на рис. 2.
Результаты многофакторного регрессионного анализа (модель пропорциональных рисков Кокса) и пошагового регрессионного анализа (оптимизированная модель) связи клинико-морфологических параметров и BRAF– статуса с интенсивностью рецидива представлены в табл. 2 и 3.
Проведенное исследование [14] подтвердило ранее установленные факты более высокой частоты мутаций BRAF в ПРЩЖ классического сосочкового строения у пациентов более старшего возраста. Новизна проведенного исследования состоит в использовании иммуногистохимического метода для оценки статуса BRAF и полученных результатов, свидетельствующих о связи мутантного BRAF с более частым и скорым развитием рецидивов в отдаленные сроки после хирургического вмешательства. Анализ данных литературы, касающихся использования иммуногистохимического метода оценки статуса BRAF, показал сопоставимые результаты с данными, полученными с помощью молекулярно-генетических методов. Результаты оценки статуса указанного онкогена, полученные в исследовании С. Martinuzzi и соавт. [11], показали совпадение с молекулярными методами до 92% (из 86 исследованных случаев). Это позволило авторам сделать заключение о перспективности использования иммуногистохимического метода оценки мутантного статуса BRAF в качестве менее затратной диагностической технологии «первой линии». Другими авторами [12, 13] получены более высокоэффективные показатели согласованности результатов иммуногистохимического и молекулярно-генетического методов оценки статуса указанного онкогена, достигающие 99%.
Заметим, что частота рецидивирования ПРЩЖ в нашем исследовании (33 (44,6%) из 74) не отражает истинный показатель по причине системно отобранных случаев ПРЩЖ с рецидивом в послеоперационном периоде. А.Ю. Абросимов [15] ранее опубликовал результаты изучения частоты рецидивирования ПРЩЖ, учтенного в базе данных Чернобыльского банка ткани щитовидной железы, соответствующие 9,6%.
Данные литературы о прогностической значимости BRAFV600E весьма противоречивы. Ряд исследователей [16] подчеркивают связь мутаций BRAFV600E с агрессивным поведением опухолей и неблагоприятным прогнозом, другие [17,18] допускают возможную прогностическую роль BRAFV600E наряду с мутациями промотора гена, кодирующего теломеразную обратную транскриптазу (TERT), третьи [19] не находят связи статуса BRAF с особенностями клинического течения и прогнозом. Несомненно, данное исследование, выполненное на относительно небольшом количестве материала, требует проведения не только анализа влияния статуса BRAF на выбор объема хирургического вмешательства, но и на радиойодотерапию с учетом ее эффективности, суммарной активности и количества курсов, а также интенсивности и длительности супрессивной гормональной терапии. Представляется закономерной обнаруженная связь инкапсулированности опухоли с пониженным риском рецидивирования, отмечавшаяся как в наших работах, так и в докладах других исследователей [20, 21].
Различия в прогностической значимости BRAFV600E, полученные разными авторами на материале ПРЩЖ у лиц европеоидных и азиатских популяций [22], вероятно, могут отчасти быть связаны с этническими особенностями изученных субпопуляций и региональной диеты, которые следует учитывать при построении прогноза, ассоциированного со статусом BRAF. В то время как в европеоидных популяциях прогностическая значимость BRAFV600E представляется более вероятной, в японской популяции, к примеру, прогностической разницы между ПРЩЖ с BRAFV600E и неизмененным геном дикого типа выявлено не было [23]. Полученные результаты позволяют предположить, что выявление экспрессии мутантного BRAF может являться фактором риска развития рецидива ПРЩЖ в послеоперационном периоде у пациентов из России.
Вывод
Иммуногистохимический метод позволил установить наличие экспрессии мутантного BRAF в 39,2% случаев ПРЩЖ. Отмечено высокое соответствие BRAF-позитивных и BRAF-негативных первичных и метастатических (рецидивных) опухолей. Подтверждена ранее выявленная связь мутантного статуса BRAF c более старшим возрастом пациентов и классическим сосочковым гистологическим типом опухолей. Обнаружены достоверные различия в более высокой частоте иммуноэкспрессии мутантного BRAF у пациентов с рецидивами опухоли в послеоперационном периоде. Кроме того, присутствие мутантного статуса BRAF связано с интенсивностью рецидива независимо от объема выполненного хирургического вмешательства, что дает основания рекомендовать этот тест в качестве одного из предикторов неблагоприятного клинического прогноза.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
This work was supported by the Program of the Network-Type Joint Usage/Research Center for Radiation Disaster Medical Science.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.Ю.А., С.Я., В.А.С.
Сбор и обработка материала — А.В.С., А.Ю.А., Т.И.Р., П.О.Р., К.С.Н., П.А.И., А.П.Ш
Статистическая обработка — В.А.С.
Написание текста — А.В.С., А.Ю.А., В.А.С.
Редактирование — А.Ю.А., П.О.Р., В.А.С
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Абросимов Александр Юрьевич — д-р мед. наук, проф., зав. отд. патоморфологии; http://orcid.org /0000-0001-8284-9996; e-mail: abrosim@mrrc.obninsk.ru
Сидорин Алексей Владимирович — https://orcid.org /0000-0003-1804-5189; e-mail: mrnc-patholog.sidorin@ya.ru