Генитальный эндометриоз занимает одно из первых мест в структуре гинекологических заболеваний. Одной из драматических черт эндометриоза является бесплодие, точное представление о причинах которого, несмотря на многочисленные исследования, до сих пор отсутствует. Частота бесплодия у больных эндометриозом в 3—4 раза выше, чем в общей популяции женщин, при этом, по данным литературы [1], более 70% случаев бесплодия связано с такой патологией эндометрия, как гиперплазия, полипы, хронический эндометрит, часто сочетающийся с эндометриозом. Предполагается, что причинами бесплодия при эндометриозе также могут являться и нарушения структуры эндометрия, возникающие на молекулярном уровне. В последние годы стало широко применяться понятие «рецептивность эндометрия», которое подразумевает способность эндометрия к «диалогу» с эмбрионом и позиционируется как комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с четкими временны́ми (20—24-й день менструального цикла — «окно имплантации») и пространственными константами, определяющий способность эндометрия к имплантации [2]. В этот комплекс входят следующие структурные и молекулярные маркеры: пиноподии, молекулы адгезии, факторы роста, цитокины и их рецепторы — семейство IL-1, LIF и LIF-R, интегрин αvβ₃, EGF, HB-EGF, L-селектин, CSF-1, IGF, IFN-г, FGF, ECM-MMP и др. Кроме того, развитие пиноподий, открытие и закрытие «окна имплантации» регулируются рядом генов, в том числе генами семейства HOX, АроЕ, PLA2, ebaf, BK66, ITF и др. [2, 3].

Данные об изменении рецептивности эндометрия у пациенток, страдающих первичным бесплодием на фоне эндометриоза, немногочисленны и противоречивы [4—6]. Важнейшим структурным маркером рецептивности эндометрия считаются пиноподии, количество которых является предиктивным фактором имплантации. Установлено, что у женщин с умеренным или незначительным количеством пиноподий вероятность наступления беременности значительно уменьшена либо невозможна [7]. Различные заболевания и патологические состояния эндометрия (гиперплазия, воспаление, неполноценная секреторная трансформация и др.) могут привести к нарушению формирования и изменению качества пиноподий и как следствие к нарушению рецептивности эндометрия [8]. В работах Е.А. Коган и соавт. [9] установлено, что у больных хроническим эндометритом наблюдается расстройство рецептивности эндометрия, включающее повреждение поверхностного эпителия слизистой оболочки матки и нарушение созревания пиноподий к моменту «окна имплантации».

Наиболее изученным классом цитокинов, играющих роль в процессе имплантации, является семейство интерлейкина-6, основными представителями которого являются ЛИФ (лейкемия-ингибирующий фактор) и ИЛ-6. Считается, что во время имплантации ЛИФ участвует как в фазе адгезии, так и в фазе инвазии бластоцисты [10]. Показано, что мутация в гене ЛИФ у женщин проявляется снижением биологической активности этого цитокина в эндометрии, приводит к нарушению процесса имплантации, что может являться причиной репродуктивных потерь у женщин с необъяснимым бесплодием и эндометриозом [11].

Интегрин αvβ₃ участвует в начальном прикреплении бластоцисты к эндометрию и регулирует межклеточные взаимодействия. Его экспрессия наблюдается как в стромальном, так и в железистом компоненте эндометрия [6, 12]. Выявлена взаимосвязь снижения или полного прекращения экспрессии ανβ₃-интегрина у женщин с эндометриозом, синдромом поликистозных яичников, гидросальпинксом и другой патологией маточных труб [13].

Другим важнейшим маркером рецептивности эндометрия считается плацентарный белок РР14, называемый сегодня гликоделином. Гликоделин, А появляется на поверхности эндометрия во время «окна имплантации», продолжает экспрессироваться в I триместре беременности и обладает мощной иммуносупрессорной активностью, обеспечивая локальное подавление иммунного ответа матери на развивающийся эмбрион [14]. Известно, что гликоделин, А подавляет пролиферацию и индуцирует апоптоз Т-клеток, модулирует продукцию цитокинов в NК-клетках и индуцирует цитокиновый Th2-сдвиг [15].

НОХА-10 — один их важных белков, определяющих рецептивность эндометрия. НОХА-10 принимает участие в процессах пролиферации и дифференцировке клеток, регулирует образование пиноподий и активность продукции интегрина αvβ₃. Экспрессия НОХА-10 значительно возрастает в среднюю и позднюю секреторную фазу менструального цикла [16]. В ряде работ [17] отмечено снижение экспрессии НОХА-10 в эутопическом эндометрии в период «окна имплантации» у пациенток с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ).

Эстрадиол и прогестерон регулируют большинство идентифицированных маркеров «окна имплантации». Высокий уровень эстрадиола и высокая экспрессия эстрогеновых рецепторов α (ЭР-α) при НГЭ стимулируют пролиферацию эндометрия, изменяют нормальный характер генной экспрессии и снижают имплантационную способность эндометрия [18]. Показано, что гиперэкспрессия ЭР-α в лютеиновую фазу цикла вызывает нарушение экспрессии биологических маркеров имплантации, в том числе интегрина αvβ₃ [19]. Важным фактором нормального функционирования эндометрия является адекватное соотношение количества экспрессируемых стероидных рецепторов клетками стромы эндометрия. В норме показатель соотношения прогестероновых и эстрогеновых рецепторов (PgR/ER) в строме колеблется от 2 до 4. Любой дисбаланс в экспрессии стероидных гормонов и их рецепторов может привести к изменению морфофункциональных свойств эндометрия и, следовательно, нарушению его рецептивности [20].

Известно, что метаболическая активность эстрогенов модулируется посредством особых ферментных систем, принадлежащих к цитохромам Р-450. Ароматаза является изоформой цитохрома Р-450 и конвертирует андрогены в эстрогены. При эндометриоидной болезни экспрессия этого фермента выявляется как в очагах эндометриоза, так и в эутопическом эндометрии [21, 22].

Цель настоящего исследования — изучение рецептивности эндометрия у бесплодных женщин с НГЭ путем определения структурных и молекулярных перестроек эндометрия экспрессии интегрина αvβ₃, ЛИФ гликоделина А, HOXA-10, ПР, ЭР-α, ароматазы иммуногистохимическим (ИГХ) методом и мРНК генов ЛИФ, ЛИФР, эстрогенового 1 и прогестеронового рецепторов, HOXА-10, PTEN методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с обратной транскрипцией.

Проведены клинико-морфологическое, иммуногистохимическое и молекулярно-генетическое исследования ткани биоптатов эндометрия 148 женщин в возрасте от 25 до 38 лет, проходивших лечение по поводу бесплодия во ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России: 50 женщин с НГЭ I—II стадии (по пересмотренной классификации Американского общества фертильности), 44 женщины, подвергнутых оперативному вмешательству на яичниках по поводу эндометриоидных кист яичника (ЭКЯ). Группу сравнения представил эндометрий от 54 женщин с трубно-перитонеальным фактором (ТПФ) бесплодия, удачной попыткой экстракорпорального оплодотворения. Всем больным проводили общеклинические и специальные методы исследования, включая УЗИ органов малого таза с оценкой овариального резерва, мониторинг фолликулогенеза, констатацию овуляции; определение гормонального статуса. Аспирационную пайпель-биопсию эндометрия выполняли под ультразвуковым контролем области дна матки на 6—8-й день после овуляции («окно имплантации»). Материал фиксировали в 10% забуференном формалине. Изучали серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, метиленовым синим, пикрофуксином по ван Гизону, проводили PAS-реакцию по общепринятым методикам.

ИГХ-реакции проводили на серийных депарафинированных срезах толщиной 3 мкм. Использовали мышиные моноклональные антитела к ЭР-α в разведении 1:100 (клон 1D5 RTU, DAKO, Дания), ПР-А (1:100, клон 636 RTU, DAKO, Дания), ЛИФ – кроличьи поликлональные антитела (1:100, «Sigma», США), гликоделин, А — мышиные моноклональные антитела (1:100, клон 6F2, «Santa Cruz Biotechnology», США), НОХА-10 — кроличьи поликлональные антитела (1:200, «GenWay Biotech», США), интегрин αvβ₃ — мышиные моноклональные антитела (1:100, клон 23С6, «Gene Tex», США), ароматазу — кроличьи поликлональные антитела (1:20, CYP19A1, «Novus Biologicals», США). Для визуализации реакций применяли систему выявления REAL EnVisionTM (DAKO, Дания). Негативные контрольные реакции проводили с мышиной сывороткой (нормальный мышиный иммуноглобулин). Ядра докрашивали гематоксилином Майера.

Анализ результатов ИГХ-реакций для ЭР-α и ПР-А проводили с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности их окраски в железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета Histo-score по формуле: HS = 1a+2b+3c, где а — количество слабо окрашенных клеток, %; b — количество умеренно окрашенных клеток, %; с – число клеток с выраженным окрашиванием, %; 1, 2, 3 — интенсивность окрашивания, баллы.

Степень выраженности экспрессии ЭР-α и ПР-А расценивали так: 0— 10% — отсутствие экспрессии, 11—100% — слабая экспрессия, 101—200% — умеренная экспрессия, 201—300% — выраженная экспрессия.

Результаты ИГХ-реакций для ЛИФ, гликоделина А, интегрина αvβ₃, ароматазы и НОХА-10 оценивали полуколичественным методом в баллах: отсутствие окрашенных клеток (–) — 0 баллов; менее 20% окрашенных клеток (+) — 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) — 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) — 6 баллов.

У 44 больных (17 с НГЭ I—II стадии и 27 с ТПФ) методом количественной ПЦР в режиме реального времени с предварительной реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) определяли уровень экспрессии мРНК генов цитокинов (LIFR, LIF), эстрогенового и прогестеронового рецепторов (ER1, PgR), гена гомеобокса (HOXA-10), опухолевого супрессора PTEN. Количество транскриптов оценивали относительно референсных генов HPRT1, В2М, GUSB методом сравнения индикаторных циклов (метод ΔΔCq). За 1 была принята медиана (Ме) значений уровня экспрессии в контрольной группе пациенток. В работе использовали коммерческие реактивы фирмы ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Россия).

Статистическую обработку данных проводили, используя программы (SPSS 17.0 (Inc., США), определяли критерий Стьюдента, а также результаты непараметрического анализа по Манну—Уитни. Статистически значимыми считались различия при р<0,05 (95% уровень значимости) и при р<0,01 (99% уровень значимости). Связь между изучаемыми показателями оценивали по результатам корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Пирсона или Спирмена.

При сравнении состояния эндометрия периода «окна имплантации» больных с разными формами бесплодия статистически значимых различий в частоте встречаемости определенных стадий развития эндометрия выявлено не было. Эндометрий соответствовал средней стадии секреции у 34 (68%) больных НГЭ I—II стадии, 34 (77,3%) больных с ЭКЯ и у 42 (77,8%) пациенток с ТПФ бесплодия. Во всех остальных случаях структура эндометрия соответствовала ранней стадии секреции.

При оценке количества клеток поверхностного эпителия эндометрия, содержащих зрелые пиноподии, установлено, что у больных НГЭ I—II стадии и ЭКЯ среднее количество поверхностных эпителиоцитов, имеющих зрелые пиноподии, было ниже, чем у больных с ТПФ бесплодия, причем наименьшее количество клеток со зрелыми пиноподиями выявлялось у пациенток с ЭКЯ, оно было в 1,7 раза меньше, чем у больных НГЭ I—II стадии, и в 2,4 раза меньше, чем в группе сравнения (рис. 1, а).

Уменьшение количества клеток поверхностного эпителия эндометрия, содержащих зрелые пинополии в период «окна имплантации», может приводить к нарушению взаимодействия эмбриона с эндометрием, так как прикрепление бластоцисты происходит на поверхности эндометриальных пиноподий и гипотетически рецепторы, необходимые для адгезии бластоцисты, локализуются на поверхности пиноподий.

Эстрогеновые и прогестероновые рецепторы

При ИГХ-исследовании ЭР-α и ПР-А выявляли в виде коричневого окрашивания ядер клеток эндометрия. Уровень экспрессии ЭР-α в эпителии эндометрия больных с ЭКЯ и НГЭ I—II стадии были достоверно выше по сравнению с контрольной группой (р>0,05): 105,0±9,1, 102,9±9,2 и 62,4±5,9 соответственно). В клетках стромы эндометрия уровни экспрессии ЭР-α во всех группах были низкие, значимо не различались между собой, и составили 61,6±10,9% у больных с ЭКЯ, 46,8±6,4% у больных НГЭ I—II стадии и 48,9±2,7% у больных с ТПФ (рис. 2, а).

Уровень экспрессии ПР-А в эпителии эндометрия у больных с ЭКЯ, НГЭ I—II стадии и ТПФ был умеренным и составил 128,3±12,0, 130,3±11,1 и 106,8±10,9% соответственно. При этом у больных с обеими формами эндометриоза отмечалась тенденция к увеличению экспрессии ПР-А в эпителии по сравнению с конрольной группой, однако различия не были статистически значимы. В клетках стромы эндометрия уровень экспрессии ПР-А во всех группах был более высоким и составил 170,9±8,4% для больных с ЭКЯ, 158,8±7,0% для пациенток с НГЭ I—II стадии и 151,1±5,9% для больных с ТПФ. При этом наиболее высокий уровень экспрессии ПР-А отмечался в строме больных с ЭКЯ (см. рис. 2, б). Средний уровень соотношения ПР-А/ЭР-α в строме у больных с ЭКЯ и НГЭ I—II стадии был значительно выше, чем у больных с ТПФ, и составил 7,4±1,1 и 13,8±4,4 против 3,3±0,1 соответственно (р=0,013 и р=0,007). Таким образом, в клетках стромы эндометрия больных с НГЭ I—II стадии и ЭКЯ обнаружен дисбаланс экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов.

Ароматаза. Продукт реакции коричневого цвета локализовался в цитоплазме клеток. У пациенток с эндометриозом уровень экспрессии этого маркера в поверхностном эпителии, эпителии желез и в клетках стромы эндометрия был достоверно выше, чем в конторольной группе (р<0,05). При этом максимальный уровень экспрессии ароматазы наблюдался у больных с ЭКЯ. Так, экспрессия ароматазы в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия у пациенток с ЭКЯ составила 5,8±0,2, 4,8±0,3 и 4,4±0,4 балла соответственно, у пациенток с НГЭ I—II стадии — 5,6±0,3, 4,0±0,4 и 3,6±0,5 балла, в контрольной группе — 3,7±0,3, 1,9±0,4 и 2,0±0,4 балла. Экспрессия ароматазы клетками эндометрия у больных эндометриозом приводит к увеличению локальной концентрации эстрогенов и эстрогеновых рецепторов, что обеспечивает нарушение рецепторного статуса эндометрия (см. рис. 1, б, рис. 2, в).

Продукт реакции коричневого цвета локализовался в цитоплазматической мембране эпителиальных клеток. У больных с НГЭ I—II стадии и ЭКЯ уровень экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии эндометрия был значительно ниже, чем в группе сравнения, и составил 4,8±0,3, 4,2±0,7 и 5,7±0,3 балла соответственно (р=0,048 и р=0,025). При этом самый низкий уровень экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии эндометрия отмечался у пациенток с ЭКЯ. Уровень экспрессии ЛИФ в железистом эпителии и строме эндометрия во всех группах значимо не отличался и составил для больных НГЭ I—II стадии 1,8±0,7 и 1,0±0,7 балла, для пациенток с ЭКЯ 2,9±0,7 и 1,8±0,6 балла, для больных группы сравнения по 0,6±0,4 балла соответственно (см. рис. 1, в, см. рис. 2, г). Снижение экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии эндометрия у больных эндометриозом может оказать негативное влияние на процесс имплантации и наступление беременности.

Продукт реакции коричневого цвета локализовался в цитоплазматической мембране и цитоплазме клеток. У больных с ЭКЯ и с НГЭ I—II стадии уровень экспрессии маркера в поверхностном эпителии эндометрия был ниже, чем в группе сравнении, и составил 1,8±0,4, 3,4 и 4,0±0,4 балла соответственно. Достоверно самый низкий уровень экспрессии НОХА-10 в поверхностном эпителии эндометрия отмечался у больных с ЭКЯ. При этом по сравнению с пациентками с НГЭ I—II стадии уровень экспрессии НОХА-10 у пациенток с ЭКЯ был ниже в 1,9 раза. Отмечалась прямая умеренная корреляция степени тяжести НГЭ и уровня экспрессии НОХА-10 в поверхностном эпителии эндометрия (rS=0,5; р=0,001). Экспрессия НОХА-10 в клетках железистого эпителия обеих групп больных эндометриозом была также более низкой (ЭКЯ 1,0±0,4 балла, НГЭ I—II стадии 0,8±0,3 балла), чем у больных с ТПФ бесплодия (1,7±0,8 балла), однако статистически значимой разницы выявлено не было. В клетках стромы эндометрия наиболее низкая экспрессии НОХА-10 обнаружена у больных с ЭКЯ. Уровень экспрессии маркера был почти в 2,5 раза меньше, чем у больных НГЭ I—II стадии и ТП, и составил 0,4±0,2, 1,0±0,5 и 0,9±0,6 балла соответственно (р=0,049) (см. рис. 1, г, см. рис. 2, д). Снижение у больных эндометриозом уровня экспрессии НОХА-10, оказывающего существенное влияние на рецептивность эндометрия, может приводить к уменьшению частоты имплантации эмбрионов у этих больных.

Продукт реакции коричневого цвета локализовался в цитоплазматической мембране клеток. У больных с ЭКЯ и НГЭ I—II стадии уровень экспрессии интегрина αvβ₃ в поверхностном эпителии эндометрия был ниже, чем у больных с ТПФ бесплодия, и составил 0,7±0,4, 1,5±0,4 и 2,4±0,4 балла соответственно. При этом самый низкий уровень экспрессии интегрина αvβ₃ в поверхностном эпителии эндометрия отмечался у больных с ЭКЯ (р>0,05). Отмечалась прямая умеренная корреляция степени тяжести эндометриоза и уровня экспрессии интегрина αvβ₃ в поверхностном эпителии эндометрия (rS=0,5; р=0,003). Уровень экспрессии интегрина αvβ₃ в железистом эпителии эндометрия больных НГЭ I—II стадии и ЭКЯ значимо не отличался и составил 0,2±0,2 и 0,1±0,1 балла соответственно (р>0,05). Экспрессия интегрина αvβ₃ в строме эндометрия наблюдалась только у пациенток с НГЭ I—II стадии и составила 0,2±0,4 балла. В группе сравнения экспрессия данного маркера отсутствовала как в железистом эпителии эндометрия, так и строме (см. рис. 1, д, см. рис. 2, е). Снижение экспрессии молекулы клеточной адгезии интегрина αvβ₃ на люминальной поверхности эпителиальных клеток эндометрия у больных эндометриозом может являться одним из факторов, изменяющих рецептивность эндометрия и, следовательно, нарушающих нормальное взаимодействие бластоциты и эндометрия при имплантации.

Продукт реакции коричневого цвета локализовался в цитоплазматической мембране клеток. У больных с НГЭ I—II стадии и ЭКЯ уровень экспрессии гликоделина, А в поверхностном эпителии эндометрия был значимо ниже, чем в группе сравнения, и составил 1,0±0,3, 0,9±0,3 и 1,7±0,3 балла соответственно (р<0,05). При этом самый низкий уровень экспрессии гликоделина, А в поверхностном эпителии эндометрия отмечался у больных с ЭКЯ. Уровень экспрессии гликоделина, А в железистом эпителии эндометрия во всех группах достоверно не различался и составил 0,5±0,3 балла у больных с НГЭ I—II стадии, 0,4±0,3 балла у больных с ЭКЯ и 0,6±0,4 балла в группе сравнения. В строме эндометрия во всех исследуемых группах экспрессия гликоделина, А отсутствовала (см. рис. 1, е, см. рис. 2, ж). Гликоделин, А — один из основных белковых продуктов эндометрия, обладающий мощной иммуносупрессорной активностью. Снижение экспрессии гликоделина, А в поверхностном эпителии эндометрия у больных эндометриозом может играть важную роль в изменении иммунотолерантности фетоплацентарной системы, приводить к нарушению имплантации или невынашиванию беременности.

При анализе экспрессии мРНК генов нескольких функциональных классов установлено, что у больных НГЭ по сравнению с больными ТПФ бесплодия определяется достоверно значимое снижение уровня экспрессии мРНК ряда генов: гена гомеобокса НОХА-10 в 1,4 раза (р=0,014), гена рецептора ЛИФ (LIFR) в 1,7 раза (р=0,037), гена прогестеронового рецептора (PgR) в 1,6 раза (р=0,029) (см. таблицу).

Снижение уровня экспрессии мРНК генов НОХА-10, LIFR, PgR согласуется с данными, полученными при ИГХ-исследовании, и может указывать на нарушение рецептивности эндометрия у больных НГЭ.

1. Результаты морфологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического исследований, сопоставимые с данными литературы, показали, что у бесплодных женщин с НГЭ I—II стадии и ЭКЯ нарушается рецептивность эндометрия, при этом выраженность нарушения рецептивности эндометрия коррелирует со степенью тяжести основного заболевания. На морфологическом уровне нарушение рецептивности эндометрия проявляется уменьшением количества клеток поверхностного эпителия, содержащих зрелые пиноподии. Иммуногистохимически в поверхностном эпителии эндометрия бесплодных женщин с эндометриозом, определяется снижение экспрессии ключевых маркеров рецептивности: интегрина αvβ₃, ЛИФ, гликоделина А, НОХА-10, а также выявляются дисбаланс между экспрессией эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в клетках стромы эндометрия и усиление синтеза ароматазы, которое можно расценить как попытку эндометрия компенсировать гормональный дисбаланс. Молекулярно-генетическое исследование выявляет снижение уровней экспрессии мРНК генов НОХА-10, LIFR и PgR, что подтверждает данные ИГХ-исследования.

2. При рутинном морфологическом исследовании эутопический эндометрий женщин с НГЭ может выглядеть неизмененным, но при этом обладать молекулярной незрелостью и как следствие нарушенной рецептивностью. Изменение экспрессии молекулярных маркеров рецептивности эндометрия у больных с НГЭ I—II стадии и ЭКЯ может являться одним из патогенетических механизмов как бесплодия в результате нарушения процесса имплантации, так и прогрессирования эндометриоза. Следовательно, для оценки роли эндометрия в развитии бесплодия в программу обследования женщин с НГЭ необходимо включить ИГХ-исследование молекулярных маркеров рецептивности и определение статуса пиноподий поверхностного эпителия эндометрия периода «окна имплантации».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.Б. П, Е.А.К.

Сбор и обработка материала — Н.Б.П., А.В.К., О.В.Б.

Статистическая обработка — А.В.К.

Написание текста — Н.Б.П.

Редактирование — Е.А.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Парамонова Нина Борисовна — канд. мед. наук, доц. каф. патологической анатомии им. акад. А.И. Струкова; https://orcid.org /0000-0001-5380-7113; e-mail: paramonova_nina@mail.ru