Развитие синдрома АКТГ-зависимого гиперкортицизма связано с образованием опухолей, способных к секреции избыточного уровня адренокортикотропного гормона (АКТГ). Главной составляющей этого синдрома является болезнь Иценко—Кушинга (БИК), которая встречается в 85% случаев. АКТГ-эктопический синдром (АКТГ-ЭС) диагностируют реже (до 15% случаев) [1, 2]. Причиной БИК являются АКТГ-секретирующие опухоли гипофиза (кортикотропиномы). АКТГ-ЭС обусловлен возникновением различных по локализации и потенциалу злокачественности новообразований (карциноиды легких, тимуса и органов желудочно-кишечного тракта, мелкоклеточный рак легкого, медуллярный рак щитовидной железы и др.), которые также могут продуцировать АКТГ в избыточном количестве [3, 4].

АКТГ-секретирующие опухоли разнообразны по локализации, морфологическому строению и степени злокачественности. Однако, учитывая сходную клиническую картину, общее происхождение указанных новообразований (из клеток диффузной нейроэндокринной системы), отечественные и зарубежные авторы [5—7] указывают на похожие гистологические и иммуногистохимические черты кортикотропином и эктопических АКТГ-секретирующих новообразований. В настоящем исследовании проведен сравнительный анализ гистологических и иммуногистохимических характеристик гипофизарных (кортикотропином) и негипофизарных АКТГ-секретирующих опухолей.

Объектом исследования были 83 пациента. У всех обследованных, у которых были удалены опухоли, продуцирующие АКТГ, наблюдалась клиническая картина эндогенного гиперкортицизма (гиперпигментация кожных покровов, перераспределение жировой клетчатки по кушингоидному типу, мышечная слабость проксимальных отделов конечностей, остеопенический синдром, при гормональном исследовании крови выявлялись нарушение ритма суточной секреции и повышение уровней АКТГ и кортизола, гиперкортизолурия в суточной моче). В зависимости от локализации новообразований (гипофизарная и негипофизарная) пациенты были распределены на две группы: 46 пациентов с болезнью Иценко—Кушинга (5 мужчин, 41 женщина в возрасте 20—58 лет) и 37 пациентов с АКТГ-ЭС (14 мужчин, 23 женщины в возрасте 21—77 лет).

Больные были прооперированы в период с 2000 по 2011 г. Объем удаленных тканей был достаточен для гистологического и иммуногистохимического исследований. Всем пациентам с БИК выполняли трансназальную транссфеноидальную аденомэктомию гипофиза. Пациентам с АКТГ-ЭС и опухолями легких выполняли резекцию или удаление доли, в которой находилось новообразование, пациентке с опухолью почки — нефрэктомию, больным с опухолью тимуса удаляли опухоль переднего средостения и пациенту с новообразованием аппендикса — аппендэктомию в отделении эндокринной хирургии Эндокринологического научного центра.

Морфологическое исследование проведено в лаборатории патоморфологии Эндокринологического научного центра. Морфологический анализ операционного материала включал гистологический и иммуногистохимический методы исследования.

Удаленные опухоли 24 ч фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. После фиксации производились обезвоживание, уплотнение и заливка материала в парафин. Полученные парафиновые срезы толщиной 5 мкм депарафинировали, окрашивали гематоксилином и эозином. На основании световой микроскопии проводили верификацию диагноза аденом гипофиза (базофильные, оксифильные, хромофобные, смешанные) и карциноидных опухолей (типичных, атипичных) легких и бронхов, почек, вилочковой железы, мелкоклеточного рака легкого в соответствии с гистологической классификацией ВОЗ (от 1993 г. — для аденом гипофиза, от 2004 г. — для эктопических АКТГ-секретирующих опухолей легких и тимуса, от 2010 г. — для эктопической АКТГ-секретирующей опухоли аппендикса).

В 46 кортикотропиномах и 30 опухолях, ассоциированных с АКТГ-ЭС, выполнено иммуногистохимическое исследование с первичными антителами — АКТГ, соматотропным (СТР), лютеинизирующим (ЛГ), фолликулостимулирующим (ФСГ) гормонами, пролактином (ПРЛ), кортикотропным рилизинг-гормоном (КРГ), Ki-67, CD31 и сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF).

В качестве вторичных антител и системы визуализации использован чувствительный комплекс универсальных антител с авидинстрептавидинпероксидазной системой, не содержащей биотин («Nichirei», Япония).

В 6 кортикотропиномах и 3 опухолях, ассоциированных с АКТГ-ЭС, выполнено иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) по методике двойного окрашивания для выявления двух гормонов в одном срезе опухоли.

С этой целью мы использовали набор для двойного окрашивания EnVision («Dako») G/2 DoublestainSystem, Rabbit/Mouse (DAB+/PermanentRed).

Экспрессию АКТГ, КРГ, ПРЛ, СТГ, ЛГ, ФСГ оценивали в 10 полях зрения при увеличении микроскопа 400 как положительную (окрашено более 10% опухолевых клеток) или отрицательную (окрашено менее 10% опухолевых клеток). Экспрессию VEGF, CD31 оценивали в 10 полях зрения при увеличение микроскопа 400 как положительную (для VEGF окрашено более 30% клеток опухоли, для CD31 окрашено более 30% эндотелиальных клеток) или отрицательную (окрашено менее 30% клеток). Индекс метки Ki-67 исследовали в 5 полях зрения при увеличении микроскопа 400 и рассчитывали как процентное отношение числа позитивно окрашенных ядер к общему числу ядер в опухоли (общая выборка составила 1000 ядер).

В качестве положительного контроля использовали ткань папиллярного рака щитовидной железы для CD31, VEGF, для Ki-67 — ткань лимфатического узла.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 6,0. При анализе данных оценивали медиану для описания количественных признаков (для параметрического и непараметрического видов распределения). Для сравнения двух независимых групп по количественным признакам, которые не являлись нормально распределенными, использовали критерий Манна—Уитни. Анализ качественных признаков в двух независимых группах проводили с помощью критерия χ². Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

Гистологическое исследование показало, что у всех пациентов с БИК причиной заболевания являлись доброкачественные опухоли гипофиза (рис. 1, а).

У пациентов с АКТГ-ЭС 24 опухоли обнаружены в бронхолегочной системе (23 карциноида легких (см. рис. 1, б) и 1 мелкоклеточный рак легкого — МКРЛ), 4 нейроэндокринных опухоли (НЭО) в вилочковой железе: 2 атипичных карциноида, 1 типичный карциноид и 1 крупноклеточная нейроэндокринная карцинома; 1 типичный карциноид почки и 1 нейроэндокринное новообразование (G2) аппендикса (см. рис. 1, в—г). На момент выявления источника гиперсекреции АКТГ у 4 пациентов наблюдались метастатические поражения: при МКРЛ — в регионарных лимфатических узлах, в 1 атипичном карциноиде тимуса — в диафрагмальном нерве, при крупноклеточной НЭО тимуса — в левой брахиоцефальной вене, НЭО (G2) аппендикса — в лимфатических узлах в области бифуркации аорты. Рецидив заболевания после хирургического лечения наблюдался у 4 пациентов: 2 карциноида легкого (в одном случае с образованием метастаза в печени), 1 типичный карциноид тимуса (обнаружены метастазы в лимфатических узлах шеи, в медиастинальной плевре, костях таза), 1 атипичный карциноид тимуса с метастазами в паратрахеальной клетчатке. Сроки развития рецидивов составили от 1 года до 5 лет после удаления первичного очага.

Таким образом, все АКТГ-секретирующие опухоли гипофиза были доброкачественными. По тинкториальным признакам среди них преобладали базофильно-клеточные (52,2%). В этих новообразованиях обнаружены такие вторичные изменения, как очаги некроза и кровоизлияний, отек стромы. Выявлены митозы и ангиоматоз.

При исследовании опухолей с эктопической секрецией АКТГ выявлены различные по локализации, морфологическому строению и степени злокачественности новообразования (атипичный и типичный карциноид, МКРЛ). Среди них преобладали атипичные карциноиды легких.

В 4 случаях отмечено образование метастазов в разных структурах.

Для комплексной функциональной оценки в 46 кортикотропиномах и 18 АКТГ-эктопических новообразованиях проводили иммуногистохимические реакции с антителами к АКТГ. В 46 гипофизарных и 18 негипофизарных АКТГ-секретирующих опухолях также определяли экспрессию ПРЛ, СТГ, ЛГ и ФСГ (экспрессия ФСГ не установлена ни в одной эктопической опухоли). Во всех АКТГ-эктопических новообразованиях исследовали экспрессию КРГ. Во всех опухолях экспрессия гормонов определялась в цитоплазме опухолевых клеток (рис. 2, а, б).

Двойному иммуноокрашиванию с антителами к тропным гормонам гипофиза подверглись 6 кортикотропином, которые являлись би- и полигормональными в результате отдельного окрашивания. В 3 АКТГ-эктопических новообразованиях, синтезирующих АКТГ и КРГ, также было выполнено ИГХИ по методике двойного окрашивания с антителами к АКТГ и КРГ. Эту процедуру проводили для подтверждения экспрессии клетками новообразований двух гормонов на одном срезе опухоли, а также для того, чтобы определить, какие клетки их синтезируют (см. рис. 2, а). Цитоплазма клеток, синтезирующих АКТГ, была окрашена в коричневый цвет. Цитоплазма клеток, экспрессирующих другие гормоны (СТГ, ПРЛ, ЛГ, ФСГ или КРГ), была маркирована розоватым цветом. Такой иммуногистохимический способ подтвердил результаты исследования с применением одного антитела на одном срезе и выявил клетки, экспрессирующие различные гормоны на срезе в одной и той же опухоли.

В результате ИГХИ экспрессия Ki-67 была выявлена в ядрах опухолевых клеток (см. рис. 2, в, г), CD31 — в эндотелиальных клетках сосудов опухолей, а VEGF — в цитоплазме опухолевых клеток. ИГХИ с указанными антителами выполнили в 46 кортикотропиномах; в АКТГ-эктопических опухолях ИГХИ с антителами к Ki-67 проведено в 20 новообразованиях, с антителами к CD31 и VEGF — в 14 эктопических АКТГ-продуцирующих опухолях.

Экспрессия Ki-67 установлена в 45 (97,8%) кортикотропиномах. Индекс метки этого маркера составлял 0,07—0,46% с медианой на уровне 0,14%. Экспрессия Ki-67 выявлена во всех эктопических опухолях. Медиана индекса метки этого маркера составила для типичных карциноидов (n=5) 1,3% (максимально 2,5%, минимально 0,5%), для атипичных карциноидов (n=13) — 3,87% (максимально 16,4%, минимально 0,32%), для крупноклеточной нейроэндокринной карциномы — 25% и для нейроэндокринного новообразования (G2) аппендикса 18,5%. Анализ индекса метки Ki-67 в кортикотропиномах и эктопических опухолях выявил достоверное различие (р<0,0000001).

Экспрессия маркера ангиогенеза CD31 обнаружена в 24 (52,2%) кортикотропиномах, VEGF — в 28 (60,9%) аденомах. В АКТГ-эктопических опухолях CD31 установлен в 1 МКРЛ, 5 атипичных карциноидах (из них в 2 — атипичные карциноиды с метастазами) и в 2 типичных карциноидах. VEGF присутствовал в 2 атипичных (без метастазов) и 1 типичном карциноиде. При анализе частоты экспрессии CD31 (р=0,3) и VEGF (р=0,7) в кортикотропиномах и эктопических опухолях достоверных различий не обнаружено.

Таким образом, результаты ИГХИ свидетельствуют о том, что среди кортикотропином преобладали моногормональные опухоли, экспрессирующие АКТГ (69,6%), остальные (30,4%), помимо АКТГ, определяющего клиническую картину заболевания, экспрессировали и другие тропные гормоны гипофиза. АКТГ-эктопические опухоли (33,3%) способны синтезировать АКТГ или КРГ коэкспрессировать АКТГ и КРГ или (n=5, 27,8%), что привело к развитию гиперкортицизма. Доли эктопических моно-, би- и полигормональных новообразований были равны (по 33,3%). Статистически значимых различий синтеза одного (р=0,2), двух (р=0,1) и более (р=0,2) гормонов среди кортикотропином и эктопических АКТГ-секретирующих опухолей не выявлено.

Индекс метки Ki-67 в АКТГ-эктопических опухолях был значительно выше, чем в кортикотропиномах. Большинство кортикотропином и АКТГ-эктопических опухолей экспрессировали CD31 и VEGF. Статистически значимых различий экспрессии указанных маркеров в кортикотропиномах и эктопических опухолях не выявлено.

В результате гистологического исследования установлено, что базофильные клетки преобладали в кортикотропиномах, что полностью соответствует данным литературы [3]. Такая окраска опухолевых клеток может быть обусловлена плотностью и количеством гранул в них (плотно гранулированные аденомы, по данным электронной микроскопии, обычно имеют базофильную окраску, редко гранулированные образования — чаще хромофобную и реже оксифильную окраску) [8]. В связи с тем, что аденогипофиз расположен в полости турецкого седла, даже небольшое увеличение размера гипофиза за счет роста опухоли может привести к сдавлению новообразования и окружающей ткани гипофиза, сосудистым нарушениям, которые морфологически проявляются в кортикотропиномах как некроз, кровоизлияния и отек [2].

Известно, что образование новых сосудов в опухоли является важным условием для роста и распространения новообразований и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом [9]. Мы выявили активную пролиферацию сосудов в 6 (13,0%) кортикотропиномах. Длительно существующий избыточный уровень АКТГ в крови способен стимулировать миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и активировать ангиогенез в опухолях [10].

В некоторых случаях при БИК первично возникает гиперплазия кортикотрофов [3, 11], а со временем из этих клеток развивается опухоль. Гиперплазия аденогипофиза может способствовать росту кортикотропиномы после ее удаления. Мы обнаружили фрагменты гиперплазии аденогипофиза в 8 (17,4%) случаях кортикотропином.

АКТГ-эктопические опухоли обладали более высоким злокачественным потенциалом, чем кортикотропиномы: при гистологическом исследовании обнаружена инвазия опухолевых клеток в сосуды, капсулу и окружающие ткани карциноидов, а также метастазирование в различные структуры.

Учитывая, что кортикотропиномы и эктопические АКТГ-секретирующие опухоли происходят из клеток диффузной нейроэндокринной системы, дают сходную клиническую картину заболевания у больных с БИК и АКТГ-ЭС, было решено исследовать эти опухоли на экспрессию гормонов гипофиза и сравнить их по этому признаку. Установили, что количество клеток в гипофизарных и негипофизарных опухолях, которые секретируют гормоны (АКТГ, КРГ), обусловливающие клиническую картину заболеваний, значительно превышало число клеток, экспрессирующих другие тропные гормоны гипофиза, а интенсивность окраски с антителами к АКТГ и КРГ была выше, чем с антителами к СТГ, ПРЛ, ЛГ и ФСГ. Эти наблюдения сопоставимы с данными других авторов [12].

В норме КРГ, синтезируемый гипоталамусом, стимулирует секрецию АКТГ в аденогипофизе. В нашем исследовании экспрессия КРГ эктопическим источником (без синтеза АКТГ), которая могла привести к гиперплазии кортикотрофов и избыточной продукции АКТГ гипофизом, установлена только в 3 случаях. В 5 случаях выявлена коэкспрессия АКТГ и КРГ. Анализ экспрессии моно-, би- и полигормональных опухолей среди кортикотропином и эктопических опухолей не установил значимых различий (для моногормональных опухолей р=0,9, для бигормональных р=0,9, для полигормональных р=0,7). Способность экспрессировать сходные гормоны такими разнообразными по строению новообразованиями можно объяснить их общим происхождением [7].

Мы попытались уточнить злокачественный потенциал АКТГ-секретирующих опухолей гипофиза и негипофизарной локализации с помощью экспрессии факторов пролиферации клеток (Ki-67) и ангиогенеза (CD31 и VEGF).

Считается, что Ki-67 является одним из наиболее специфических маркеров пролиферативной активности опухолевых клеток, который экспрессируется делящимися клетками во все активные фазы клеточного цикла и отсутствует в покоящихся клетках [13]. Наличие этого маркера в ядрах опухолевых клеток мы установили практически во всех исследуемых опухолях (кроме одной кортикотропиномы). Анализ индекса метки Ki-67 в кортикотропиномах и эктопических опухолях установил достоверное различие экспрессии Ki-67 среди указанных групп новообразований. Эти данные свидетельствуют о более активном пролиферативном процессе в опухолях, ассоциированных с АКТГ-ЭС [4].

CD31 является молекулой адгезии эндотелиальных клеток и тромбоцитов, с помощью которой можно окрасить эндотелий сосудов в опухоли, и служит показателем активности ангиогенеза. В нашем исследовании выявлена положительная экспрессия CD31 в 24 (52,2%) кортикотропиномах, МКРЛ, 4 атипичных карциноидах (в МКРЛ и 2 атипичных карциноидах наблюдали распространение метастазов в медиастинальных лимфатических узлах), что отражает активность ангиогенеза в опухолях. В исследовании H. Turner [14] установлена достоверно более низкая сосудистая плотность в кортикотропиномах, исследованная с помощью экспрессии CD31. Однако мы достоверных различий частоты экспрессии CD31 между кортикотропиномами и эктопическими опухолями (р=0,7) не выявили.

Уровень процесса новообразования сосудов тесно связан с экспрессией и концентрацией VEGF [9, 15]. Экспрессия VEGF обнаружена в 28 аденомах гипофиза и 3 эктопических опухолях (2 атипичных и 1 типичном карциноиде). Причем в НЭО при ИГХИ VEGF обычно экспрессируется в цитоплазме опухолевых клеток [14]. Статистически значимых различий частоты экспрессии указанного маркера между кортикотропиномами и эктопическими опухолями не выявлено (р=0,2).

В нашем исследовании среди маркеров злокачественного потенциала индекс метки Ki-67 является единственным, который значительно отличался в кортикотропиномах и эктопических АКТГ-секретирующих опухолях. Показатели клеточной адгезии и ангиогенеза в указанных новообразованиях независимо от их гистологического строения были сходными.

Таким образом, при исследовании гистологических и иммуногистохимических характеристик гипофизарных и негипофизарных АКТГ-секретирующих опухолей получены определенные сходства и различия.

Сходство между кортикотропиномами и АКТГ-эктопическими опухолями заключалось в способности экспрессировать кроме АКТГ (или КРГ для АКТГ-эктопических новообразований) не менее 2 тропных гормонов гипофиза (СТГ, ПРЛ, ЛГ и ФСГ), а также маркеры ангиогенеза (CD31 и VEGF) с одинаковой частотой.

Гипофизарные и негипофизарные АКТГ-секретирующие опухоли различались по гистологическому строению и степени их злокачественности: все кортикотропиномы были доброкачественными, а эктопические опухоли различались по морфологическому строению и степени злокачественности (атипичные и типичные карциноиды; крупноклеточная нейроэндокринная карцинома), часть из которых обладала метастатическими свойствами. Наиболее высокий уровень клеточной пролиферации (индекс метки Ki-67) выявлен в АКТГ-эктопических опухолях.