Смольянникова В.А.

ГБУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Александрова А.К.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия

Нарушение экспрессии белков-регуляторов клеточного цикла при себорейном кератозе

Журнал: Архив патологии. 2020;82(2): 30-34

Просмотров : 573

Загрузок : 10

Как цитировать

Смольянникова В. А., Александрова А. К. Нарушение экспрессии белков-регуляторов клеточного цикла при себорейном кератозе. Архив патологии. 2020;82(2):30-34.
Smolyannikova V A, Alexandrova A K. Impaired expression of cell-cycle regulatory proteins in seborrheic keratosis. Arkhiv Patologii. 2020;82(2):30-34.
https://doi.org/10.17116/patol20208202130

Авторы:

Смольянникова В.А.

ГБУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Все авторы (2)

Нарушения клеточного цикла являются основными факторами в формировании опухолей. Ключевую роль в регуляции пролиферативной активности клеток и запуска программы физиологического старения и апоптоза играют гены-супрессоры (TP53, р16/INK4), мутации которых хорошо изучены в большинстве злокачественных новообразований человека [1]. Доброкачественная природа себорейного кератоза (СК), наиболее распространенной эпителиальной опухоли кожи, по данным некоторых авторов, не исключает возможность его злокачественной трансформации [2, 3]. До настоящего времени морфогенез опухоли остается неясен, а результаты изучения экспрессии основных маркеров клеточного цикла крайне противоречивы и часто приводят к взаимоисключающим выводам. В большинстве работ, посвященных СК, речь идет либо о ретроспективном анализе, либо об изучении отдельных гистологических форм заболевания [4, 5]. В отличие от злокачественных новообразований в СК не выявлено мутаций в генах-супрессорах (TSC1, PTEN, TP53) [6]. Однако при иммуногистохимическом (ИГХ) — исследовании наблюдались отсутствие экспрессии белка р53 [4, 7], слабая экспрессия [8] или увеличение экспрессии в несколько раз по сравнению с показателями нормальной кожи [6]. Расширение экспрессии белка р16 на все клетки опухоли выявлено в исследованиях L.M. Hillen и соавт. [5], тогда как в работе C. Hafner и соавт. [7] экспрессия р16 соответствовала таковой в непораженном эпидермисе. В других исследованиях экспрессия р16 в СК и вовсе отсутствовала [9]. Нет ясности и о состоянии пролиферативной активности клеток СК [7, 9]. Это и определило цель нашего исследования.

Цель исследования — изучить экспрессию белков-регуляторов клеточного цикла р53, р16 и маркера пролиферативной активности клеток Ki-67 при СК.

Материал и методы

Под нашим наблюдением находились 130 пациентов с СК: 83 (63,8%) женского и 47 (36,2%) мужского пола в возрасте от 55 до 78 лет (средний возраст 63,5±8,0 лет, медиана 63 года). Гистологические и ИГХ-исследования проведены на операционном материале опухолей кожи 130 пациентов. СК был представлен плоскими, умеренно пигментированными опухолями овальной формы не более 2 см в диаметре с гиперкератотической поверхностью. 63 (48,5%) СК были удалены с участков, подверженных УФ-излучению (лицо, шея, область декольте), 67 (51,5%) — с мест, чаще закрытых, менее подверженных избыточному солнечному воздействию (живот, боковые поверхности туловища). Материал обрабатывали по стандартной методике: заливали в парафиновые блоки, из которых готовили гистологические препараты, и окрашивали гематоксилином и эозином. ИГХ-исследование проводили стрептавидин-биотин-пероксидазным методом по общепринятой схеме на парафиновых срезах толщиной 5 мкм. Результаты оценивали с помощью светового микроскопа Leica DM4000B (увеличение 100, 200 и 400). Использовали мышиные моноклональные антитела к р53 (clone DO-7, ready-to-use. Novocastra Ltd.,); мышиные моноклональные антитела к р16 (clone G175−405, разведение 1:1000 BD Pharmingen); моноклональные антитела к Ki-67 (ready-to-use, Novocastra Ltd). В качестве позитивного и негативного контроля в каждом случае использовали рекомендованные производителями образцы тканей.

Результаты ИГХ-исследования оценивали следующим образом. Для ядерного маркера р53 подсчитывали количество окрашенных ядер клеток опухоли: отсутствие реакции или окрашивание менее 10% клеток расценивали как отрицательную реакцию, от 10 до 30% — как положительную, более 30% ядер клеток — как гиперэкспрессию. Для цитоплазматического маркера р16 по интенсивности диффузного цитоплазматического окрашивания: выраженная (++) расценивалась как гиперэкспрессия, (+) — как слабая. Для ядерного маркера Ki-67 исследовали количество положительно окрашенных ядер клеток опухоли к 300 клеткам опухоли в местах с наибольшей экспрессией (увеличение 400 в трех полях зрения).

Статистическая обработка материала и расчеты показателей проведены с использованием статистического пакета программ Statistica для Windows v.10 и SPSS v.21. Для сравнения качественных параметров применяли точный критерий Фишера и χ2. Различия считали статистически значимыми при p<0,05 (95% точности). Степень взаимосвязи параметров оценивали с помощью корреляционного анализа по Спирмену.

Результаты

В результате анализа 130 гистологических препаратов распределение по гистологическим типам СК было следующим: акантотический тип — 40 наблюдений; аденоидный, клональный и раздраженный — по 30 случаев. На участках, подверженных УФ-излучению, наиболее часто встречался раздраженный тип — 27 (42,9%) СК.

При ИХГ-исследовании с моноклональными антителами к р53 положительная реакция разной степени интенсивности регистрировалась в 66 (50,7%) СК и не зависела от возраста пациентов (рис. 1).

Рис. 1. Себорейный кератоз, раздраженный тип. Экспрессия моноклональных антител к р53 в ядрах более 30% клеток. Иммунопероксидазный метод, ×100.

Экспрессия р53 в СК была диффузной и значимо коррелировала с гистологическим типом СК (R=0,42 при р=0,000001). Так, гиперэкспрессия р53 встречалась только при раздраженном типе СК в 40% случаев (р=0,0001, р=0,00001) (табл. 1).

Таблица 1. Экспрессия моноклональных антител к р53 при разных гистологических типах себорейного кератоза Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: в скобках — достоверность различий р по сравнению с раздраженным типом.

Как гиперэкспрессия, так и положительная экспрессия р53 достоверно чаще (р=0,0003 и р=0,00001 соответственно) встречалась в СК, локализованных у пациентов на местах, наиболее подверженных УФ-излучению в 92,1% (58/63 СК) случаев, в СК, расположенных на закрытых от УФ-излучения местах, — в 11,9% (8/67СК) случаев. Положительная корреляционная связь была высокозначимой (R=0,79, р=0,000001).

При ИГХ-исследовании с моноклональными антителами к р16 наблюдалась положительная реакция во всех СК в виде цитоплазматического окрашивания более 50% клеток опухоли (рис. 2).

Рис. 2. Себорейный кератоз, акантотический тип. Выраженная экспрессия моноклональных антител к р16 в клетках опухоли. Иммунопероксидазный метод, ×100.
Корреляционная зависимость от возраста пациентов была слабой (R=0,21, p=0,019) и характеризовалась усилением выраженности экспрессии после 65 лет.

На уровень экспрессии р16, как и р53 оказывала влияние локализация СК (R=0,35, p=0,000038): в 42 (66,7%) СК, удаленных с мест, подверженных повышенному влиянию УФ-излучения, наблюдалась гиперэкспрессия р16, напротив, слабая экспрессия достоверно чаще встречалась в СК, расположенных на местах, не подверженных солнечному свету, — в 68,7% (р=0,0001).

Также гиперэкспрессия р16 достоверно чаще регистрировалась при раздраженном типе СК в отличие от остальных рассматриваемых гистологических типов — акантотического, аденоидного и клонального (р=0,026, р=0,018, р=0,0008 соответственно) (табл. 2).

Таблица 2. Экспрессия моноклональных антител к р16 при разных гистологических типах себорейного кератоза
Гиперэкспрессия р16 в СК достоверно чаще сочеталась с положительной экспрессией р53 (р=0,003).

ИГХ-исследование с моноклональными антителами к Ki-67 при СК выявило низкую пролиферативную активность клеток опухоли. Количество пролиферирующих клеток находилось в пределах от 3 до 11,3% (средняя величина 5,6±2,3%). Наибольшее количество пролиферирующих клеток (8,5±4,8%) регистрировалось при раздраженном типе СК (р=0,0000001) (табл. 3).

Таблица 3. Экспрессия моноклональных антител к Ki-67 при разных гистологических типах себорейного кератоза

Уровень пролиферативной активности клеток СК коррелировал с их локализацией и был выше в опухолях, подверженных УФ-излучению (R=0,57, р=0,0000001).

Обсуждение

СК является доброкачественной эпителиальной опухолью кожи, однако вопрос о возможности его злокачественной трансформации остается открытым. В литературе описаны случаи возникновения плоскоклеточной карциномы из СК [2, 3]. О возможном злокачественном потенциале опухоли также свидетельствует выявление гиперэкспрессии р53 и р16, что было отмечено в отдельных работах зарубежных авторов [4, 6]. В нашем исследовании положительная экспрессия р53 регистрировалась только в 50,7% случаев СК, а в 92,1% была связана с локализацией опухоли на местах, подверженных интенсивному УФ-излучению. Влияние УФ-излучения на экспрессию р53 описано в работе M. El-Domyati и соавт. [10]. При изучении кожи лица и живота у людей обоего пола в возрасте от 6 до 77 лет обнаружено, что при одинаковой дозе инсоляции у пожилых сильнее повреждается ДНК кератиноцитов, чем у молодых, что прямо отражается на содержании в эпидермисе р53-позитивных клеток. Учитывая, что в непораженном эпидермисе в результате повреждений идет накопление дикого типа р53, считаем, что при СК положительная экспрессия белка также связана с накоплением и стабилизацией в ядре дикого типа р53, а не его мутантных форм. Это приводит к активации апоптоза и/или остановке клеточного цикла в G1-фазе в результате повреждений ДНК.

Ведущее нарушение клеточного цикла при СК — расширение экспрессии белка р16 наблюдалось во всех 130 исследуемых образцах. В литературе в случае повышенной экспрессии p16 в эпителиальных клетках человека соблюдаются три основные интерпретационные линии: 1) p16 —маркер прогрессирования опухоли и показатель ее злокачественности; 2) р16 — дополнительный маркер вируса при поражениях, связанных с ВПЧ; 3) р16 — маркер клеточного старения [9, 11—14]. Именно старение клеток является, на наш взгляд, основным фактором в патогенезе СК, учитывая выявленную взаимосвязь экспрессии р16 с возрастом и УФ-излучением при общей низкой пролиферативной активности опухоли по данным экспрессии Ki-67.

В многочисленных исследованиях показано, что накопление белка p16 в тканях происходит с возрастом при кумуляции повреждений ДНК, а также при влиянии избыточного УФ-излучения не за счет увеличения его синтеза, а вследствие уменьшения его деградации. Таким образом, усиление экспрессии р16 является ключевым звеном в снижении пролиферативной активности клеток при старении [13—15]. Сочетание при СК положительной экспрессии р53 на фоне гиперэкспрессии р16 может, с одной стороны, свидетельствовать об ускоренной дифференцировке клеток наряду с активацией апоптоза наиболее поврежденных клеток, а с другой — об усилении супрессорной активности и остановке клеточного цикла. Однако в отличие от акантотического, клонального и аденоидного типов СК при раздраженном типе выявлено сочетание гиперэкспрессии р16 и р53 на фоне статистически значимого повышения пролиферативной активности клеток опухоли. В работах [9, 11, 16] такая ассоциация маркеров характеризует болезнь Боуэна и плоскоклеточный рак и является диагностическим критерием злокачественной природы опухоли. Следовательно, именно раздраженный тип в силу особенностей нарушения клеточного цикла является единственной гистологической формой СК, имеющей возможность злокачественной трансформации.

Заключение

Таким образом, выявленные в исследовании нарушения экспрессии белков-регуляторов клеточного цикла при СК свидетельствуют об активации супрессорной активности опухоли и о старении кератиноцитов. Злокачественная трансформация опухоли возможна при раздраженном типе СК, учитывая достоверное повышение экспрессии р53, р16 на фоне увеличения пролиферативной активности в отличие от других его форм.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.А.С., А.К.А.

Сбор и обработка информации: А.К.А.

Написание текста: А.К.А., В.А.С.

Редактирование: В.А.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Смольянникова В.А. — https://orcid.org/0000-0002-7759-5378; e-mail: smva@bk.ru

Александрова А.К.— http://orcid.org/0000-0001-9166-9807

Автор, ответственный за переписку: Смольянникова Вера Анатольевна — e-mail: smva@bk.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail