Белки семейства клаудинов являются одними из основных структурных компонентов плотных контактов эпителиальных клеток. При изменении уровня экспрессии клаудинов в плотных контактах могут возникать функциональные нарушения, которые непосредственно ассоциированы с возникновением и прогрессированием злокачественных новообразований [1—3]. В частности, снижение экспрессии клаудинов является одним из возможных механизмов потери клеточной адгезии, вследствие чего клетки могут приобретать способность к миграции и инвазии, что определяет метастатический потенциал опухоли [2, 4].

Клаудин-3 представляет собой белок, кодируемый геном CLDN3, который расположен в хромосоме 7 (локус 7q11.23) [5, 6]. В ряде научных работ обсуждается изменение уровня экспрессии клаудина-3 в клетках рака желудка. При иммуногистохимическом исследовании положительная реакция клаудина-3 может выявляться как в мембране, так и в цитоплазме клеток аденокарциномы желудка, а также в фокусах кишечной метаплазии. При этом для прилегающего к опухоли нормального эпителия характерна более низкая экспрессия маркера либо ее отсутствие [1, 7—9].

В зависимости от гистологического типа по классификации Lauren в раке желудка определяются различные уровни экспрессии клаудина-3 [10]. Опухоли диффузного типа отличаются низкой экспрессией маркера, тогда как новообразования кишечного типа демонстрируют ее повышение [7, 11]. Z. Zhang и соавт. [7] высказывают предположение о том, что морфологическая гетерогенность аденокарцином желудка может быть связана с изменением уровня метилирования промотора гена CLDN3 и экспрессии клаудина-3. Наблюдаемое при кишечной метаплазии гипометилирование промотора CLDN3 может способствовать повышению экспрессии клаудина-3 и формированию опухолей интестинального типа. Напротив, гиперметилирование промотора CLDN3 и снижение экспрессии клаудина-3 определяют развитие аденокарцином желудка диффузного типа.

Выраженность экспрессии клаудина-3 в раке желудка соотносится с распространенностью первичной опухоли. В аденокарциномах стадии T3 и T4 уровни экспрессии маркера значительно меньше по сравнению со стадией T1 и T2 [12]. Также известно, что экспрессия клаудина-3 в участках инвазии в подслизистый и мышечный слои ниже, чем в опухолевых клетках в слизистой оболочке желудка. Следовательно, снижение экспрессии клаудина-3 может играть роль в инициации процессов стромальной и сосудистой инвазии [1, 9]. Низкая экспрессия клаудина-3 свойственна опухолям с инвазией в кровеносные и лимфатические сосуды [1, 12].

По данным H. Wang и соавт., высокая мембранная экспрессия клаудина-3 в раке желудка ассоциирована с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах [8]. Кроме того, в метастатически пораженных лимфатических узлах наблюдается уменьшение экспрессии маркера по сравнению с первичной опухолью, а также гиперметилирование промотора гена CLDN3. Предполагается, что способность к метастазированию в лимфатические узлы приобретают клетки аденокарциномы желудка, в которых происходит снижение экспрессии клаудина-3 и увеличение метилирования промотора CLDN3 [7].

Повышение экспрессии клаудина-3 в раке желудка ассоциировано с благоприятным прогнозом, причем в наибольшей степени для новообразований кишечного гистологического типа с высокой экспрессией маркера [11]. Согласно данным мультивариантного анализа, уровень метилирования промотора гена CLDN3 является независимым предиктором выживаемости больных раком желудка. Гипометилирование промотора CLDN3 ассоциировано с более высоким уровнем выживаемости, гиперметилирование — с более низким. Таким образом, гиперметилирование промотора гена CLDN3 и снижение экспрессии клаудина-3 при раке желудка можно считать неблагоприятными прогностическими факторами [7].

Представленные в литературе данные относительно изменения экспрессии клаудина-3 в клетках рака желудка и ее влияния на злокачественный потенциал новообразования являются немногочисленными и не охватывают полный спектр клинико-морфологических параметров. Отсутствуют работы, посвященные изучению ассоциации экспрессии клаудина-3 в раке желудка с наличием отдаленных метастазов, а также с локализацией и макроскопической формой опухоли.

Цель исследования — изучить экспрессию клаудина-3 в раке желудка и в прилежащей нормальной слизистой оболочке и оценить взаимосвязь уровня экспрессии с основными клинико-морфологическими характеристиками опухоли.

Материал и методы

В работе использован биопсийный и операционный материал, полученный от 69 пациентов с раком желудка. Возраст пациентов варьировал от 35 до 83 лет (средний 62,3 года). В период до операции больным не проводили неоадъювантную терапию.

Для постановки иммуногистохимических реакций использовали поликлональные мышиные антитела к клаудину-3 (RTU, Thermo Fisher Scientific, Великобритания). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов осуществляли при помощи буфера Dewax and HIER Buffer L (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) при рН 6,0 и температуре 95—98 °С в течение 20 мин в модуле предобработки (PT-Module). Постановку иммуногистохимических реакций проводили в автоматизированном режиме с помощью иммуностейнера Autostainer 480S (Thermo Fisher Scientific, США). Время инкубации составляло 30 мин. В качестве положительного контроля по рекомендации производителя использовали рак тонкой кишки.

Оценку экспрессии клаудина-3 осуществляли два независимых исследователя по методике T. Hwang и соавт. [4] (с изменениями). Отдельно изучали экспрессию маркера в опухоли и в интактной слизистой оболочке. Интенсивность окрашивания оценивали по шкале от 0 до 3 (0 — отсутствует, 1 — слабая, 2 — умеренная, 3 — выраженная). Процент окрашенных клеток оценивали по шкале 0—0%; 1 — 1—49%; 2 — 50—89%; 3 — 90%. Итоговый балл (ИБ), определяющий выраженность иммуногистохимической реакции, формировали путем умножения интенсивности окрашивания на количество прореагировавших клеток и деления полученного результата на 3. Значения И.Б. в диапазоне от 0 до 1 расценивали как слабую реакцию, от 1 до 2 — как умеренную, от 2 до 3 — как выраженную. Далее в каждом случае проводили сравнение итоговых баллов для опухоли (ИБ_о) и нормальной слизистой оболочки (ИБ_с). Экспрессию маркера в раке желудка считали высокой, если ИБ_о превышал ИБ_с; равной, если ИБ_о был равен ИБ_с; низкой, если ИБ_о был меньше ИБ_с.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного пакета Statistica 12 (StatSoft Inc., США). Для оценки различий экспрессии клаудина-3 в раке желудка и в прилежащей нормальной слизистой оболочке применяли U-критерий Манна—Уитни. Для анализа взаимосвязи уровня экспрессии клаудина-3 в раке желудка с основными клинико-морфологическими характеристиками опухоли использовали критерий χ² Пирсона и точный критерий Фишера. Уровень значимости (p) считали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Положительная мембранная реакция клаудина-3 выявлена в 49 (71%) случаях рака желудка (табл. 1).

При этом в 9 случаях отмечали слабую реакцию (рис. 1, б),

в 19 — умеренную (рис. 1, в), в 21 — выраженную (рис. 1, г). В 20 (29%) наблюдениях реакция маркера отсутствовала (рис. 1, а).

Экспрессия клаудина-3 в раке желудка была статистически значимо выше, чем в прилежащей нормальной слизистой оболочке (p<0,05). В 60 (87%) наблюдениях реакция клаудина-3 в интактной слизистой оболочке отсутствовала, тогда как в остальных случаях являлась слабо- или умеренно выраженной. Это соотносится с представленными в литературе данными, согласно которым экспрессия клаудина-3 в нормальном эпителии желудка, как правило, отсутствует либо является более низкой по сравнению с опухолевыми клетками [1, 7—9].

При оценке ассоциации между уровнем мембранной экспрессии клаудина-3 и основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка не обнаружено статистически значимой связи с локализацией опухоли, макроскопической формой, размерами, глубиной инвазии, вовлеченностью регионарных лимфатических узлов, наличием отдаленных метастазов, гистологическим типом, клинической стадией (табл. 2).

Однако установлено, что отсутствие экспрессии клаудина-3 значимо ассоциировано с низкой степенью дифференцировки опухоли (p<0,05). При этом для статистического анализа использовали только аденокарциномы желудка (n=57) без учета случаев перстневидно-клеточного рака (рис. 2).

Полученный результат согласуется со сложившимися представлениями о роли клаудинов в качестве основных белков плотных контактов эпителия. Снижение экспрессии клаудинов приводит к нарушению функций плотных контактов, что может способствовать увеличению степени злокачественности опухоли [1—4]. В работе Z. Zhang и соавт. [7] высказано предположение о том, что уменьшение экспрессии клаудина-3 и гиперметилирование промотора гена CLDN3 могут быть отличительными особенностями низкодифференцированных аденокарцином желудка.

T. Okugawa и соавт. [9] показали отрицательную корреляцию между уровнем экспрессии клаудина-3 в раке желудка и индексом клеточной пролиферации Ki-67. Снижение экспрессии клаудина-3 может быть ассоциировано с высоким пролиферативным потенциалом аденокарцином желудка. Нами было отмечено, что большинство новообразований, в которых отсутствовала экспрессия клаудина-3, имели размеры более 5 см, в то время как размеры преобладающего числа опухолей с высокой мембранной экспрессией клаудина-3 не превышали 5 см. Однако выявленная закономерность оказалась статистически незначима (p>0,05).

В 48 (69,6%) случаях рака желудка обнаружена аномальная ядерная реакция клаудина-3 (рис. 3).

Известно, что для клаудинов характерна мембранная либо мембранно-цитоплазматическая локализация в клетке [6], поэтому такое явление требует особого внимания. Аномальная ядерная реакция клаудина-3 наблюдалась в 19 из 20 случаев рака желудка с отсутствием экспрессии маркера и в 29 из 49 новообразований с положительной мембранной реакцией (рис. 4).

Ядерная экспрессия клаудина-3 в раке желудка значимо ассоциирована с отсутствием типичной мембранной и цитоплазматической экспрессии маркера (p<0,05).

В литературе отсутствуют исследования, посвященные изучению ядерной экспрессии клаудина-3 в раке желудка. Данные о наличии ядерной экспрессии маркера в других злокачественных новообразованиях немногочисленны и имеются лишь в единичных публикациях. Н.А. Олейникова и соавт. в 2017 г. [13] впервые описали ядерную реакцию клаудина-3 в раке толстой кишки: положительная ядерная реакция была выявлена в 2,5% случаев, при этом в низкодифференцированной аденокарциноме не наблюдалось типичной мембранной локализации маркера, тогда как в клетках высокодифференцированной аденокарциномы определялась слабая мембранная реакция. Y. Tokuhara и соавт. [14] обнаружили положительную ядерную реакцию клаудина-3, которая наблюдалась в 22% случаев колоректального рака и была ассоциирована с гистологическим типом опухоли: в муцинозных аденокарциномах уровень ядерной экспрессии маркера был значительно выше по сравнению с высоко- и умереннодифференцированными аденокарциномами. M. Todd и соавт. [15] обнаружили ядерную экспрессию клаудина-3 в клеточных линиях метастатического рака молочной железы. Существуют гипотезы, объясняющие механизм транслокации клаудина-3 в ядро клетки, что делает возможным непосредственное участие белка в канцерогенезе [13].

Представленные в литературе данные позволяют высказать предположение о том, что ядерная экспрессия клаудина-3 может быть ассоциирована со степенью злокачественности и метастатическим потенциалом опухоли. Этот вопрос требует дальнейшего подробного изучения.

Заключение

Впервые описана аномальная ядерная экспрессия клаудина-3 в раке желудка и установлена значимая ассоциация между наличием ядерной экспрессии и отсутствием типичной мембранной экспрессии маркера. Показано, что отсутствие экспрессии клаудина-3 значимо ассоциировано с низкой степенью дифференцировки опухоли. Экспрессия клаудина-3 может потенциально рассматриваться в качестве прогностического фактора при раке желудка.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В.Д., К.А.А., П.Г.М.

Сбор и обработка материала — Н.В.Д., К.А.А., Н.А.О, Д.В.В.

Статистическая обработка данных — К.А.А.

Написание текста — К.А.А., Н.В.Д.

Редактирование — П.Г.М.

Работа выполнена в рамках госзадания ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова.

Сведения об авторах

Данилова Н.В. — https://orcid.org/0000-0001-7848-6707; e-mail: natalyadanilova@gmail.com

Аникина К.А. — http://orcid.org/0000-0002-4669-8366

Олейникова Н.А. — http://orcid.org/0000-0001-8564-8874

Вычужанин Д.В. — http://orcid.org/0000-0001-6099-1801

Мальков П.Г. — http://orcid.org/0000-0001-5074-3513

Автор, ответственный за переписку: Данилова Наталья Владимировна — e-mail: natalyadanilova@gmail.com