Сравнительная оценка экспрессии Muc 2, Muc 5AC и Muc 6 в зубчатых новообразованиях толстой кишки

Диагностика и лечение зубчатых новообразований толстой кишки остаются в настоящее время чрезвычайно трудной и не до конца освещенной проблемой в медицине. Это связано с недостаточной осведомленностью отдельных патологоанатомов не только относительно особенностей архитектоники зубчатых образований, но и их потенциала злокачественности. До сих пор зубчатые новообразования диагностируются как доброкачественные эпителиальные опухоли или гиперпластические полипы (ГП) толстой кишки.

В соответствии с классификацией эпителиальных новообразований толстой кишки (ВОЗ, 2010) различают ГП, сидячие зубчатые аденомы/полипы без или с цитологической атипией (СЗА), традиционные зубчатые аденомы (ТЗА) [1]. Особое место среди ГП занимает микровезикулярный подтип, обладающий способностью трансформироваться в СЗА, которые наряду с традиционными являются предшественниками зубчатых аденокарцином толстой кишки [2, 3]. Зубчатые аденокарциномы впервые описаны в 1992 г. зарубежными исследователями J. Jass и M. Smith [4] как прогрессирование диспластических зубчатых образований, чаще СЗА.

Имеются данные литературы [5], касающиеся изменения экспрессии муцинов в ходе зубчатого пути канцерогенеза с характерным иммунофенотипическим признаком поздней потери кишечной и усиления желудочной дифференцировки. Несмотря на то что впервые желудочная дифференцировка зубчатых новообразований была описана в 1999 г. на основании иммуногистохимической реакции с «human gastric mucin» [6], на наш взгляд, в настоящее время недостаточно широко используются антитела к муцинам в практике патологоанатома.

Муцины — высокомолекулярные гликопротеины, которые формируют защитную систему слизистой оболочки органов пищеварительной системы. Эпителиальные клетки синтезируют несколько типов муцинов, из которых для желудка и каждого отдела тонкой и толстой кишок имеется преобладающий тип. Muc 2 секретируется преимущественно бокаловидными клетками тонкой и толстой кишок, в то время как Muc 5AC и Muc 6 экспрессируются в эпителии желудка, и крайне редко — в нормальной слизистой оболочке толстой кишки [7—9]. Гиперэкспрессия Muc 2 чаще встречается в злокачественных опухолях толстой кишки с мутацией гена BRAF, высоким метиляторным фенотипом CpG (CIMP) и микросателлитной нестабильностью [10].

По результатам исследования J. Tsai и соавт. [11], экспрессия желудочных муцинов Muc 5AC и Muc 6 связана с молекулярными особенностями зубчатого пути канцерогенеза, а именно мутацией гена BRAF и CIMP; опухоли с такой молекулярной характеристикой преимущественно локализуются в правой половине толстой кишки. Высокая экспрессия Muc 2 и Muc 5AC выявляется в опухолях с высокой микросателлитной нестабильностью [10, 12—14].

В муцинпродуцирующих аденомах толстой кишки повышается экспрессия гена Muc 2, усиливающаяся при прогрессировании и малигнизации, в то время как в немуцинпродуцирующих опухолях отмечено снижение экспрессии этого гена [15, 16]. В СЗА с и без цитологической атипии выявляется выраженная экспрессия Muc 2, сохраняющаяся и в фокусах малигнизации (зубчатой аденокарциноме) [17].

В зубчатых аденомах Muc 6 экспрессируется в базальных отделах крипт [18]. Известно, что в СЗА и ТЗА с локализацией в правой половине более выражена экспрессия Muc 6 по сравнению с расположением в левой половине толстой кишки [19]. По новым данным, экспрессия Muc 6 наиболее характерна для СЗА без признаков дисплазии, при этом уровень экспрессии сохраняется в аденомах с дисплазией разной степени и даже в инвазивной карциноме. В ГП крайне редко выявляется экспрессия маркера Muc 6 [20—22]. Наряду с этим имеются данные о том, что в СЗА с цитологической атипией и в зубчатой аденокарциноме иммуногистохимическая реакция с антителами к Muc 6 не выявляется [17]. В колоректальных раках, локализованных в правой половине толстой кишки, Muc 6 экспрессируется в 39% случаев, что сочетается с муцинозной дифференцировкой, а также с CIMP и мутацией гена BRAF [10].

Появление в клетках экспрессии Muc 5AC, в норме его не продуцирующих, является общим признаком злокачественной прогрессии, характерным не только для органов пищеварительной системы [23]. В зубчатых аденомах положительная реакция с антителами к Muc 5AC выявляется в поверхностном эпителии и вдоль длины крипты (ДК) [18]. Одновременно имеются данные о том, что выраженная экспрессия Muc 5AC обнаруживается в большем количестве клеток и с более выраженной реакцией в СЗА по сравнению с ГП [24].

Цель исследования — провести сравнительную оценку экспрессии Muc 2, Muc 5AC и Muc 6 в гиперпластических полипах, сидячих и традиционных зубчатых аденомах толстой кишки для определения их роли в дифференциальной диагностике.

Материал и методы

Исследованы 65 зубчатых образований от 52 пациентов в возрасте от 31 года до 80 лет (средний возраст 58 лет). Среди них было 26 СЗА, 26 ГП, 13 ТЗА (табл. 1).

Таблица 1. Количество случаев, исследованных на наличие мутаций генов BRAF и KRAS

Гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (рис. 1, а;

Рис. 1. Сидячая зубчатая аденома толстой кишки. а — гистологическая картина зубчатого профиля крипт с расширением базальных отделов и наличием цитологической атипии. Окраска гематоксилином и эозином, ×100; иммуногистохимическое исследование СЗА с антителами: б — к Muc 2 — выявлена выраженная экспрессия вдоль ДК и в поверхностном эпителии, ×100; в — к Muc 6 — выраженная экспрессия в ОК (базальных отделах), ×100; г — к Muc 5AC — выраженная экспрессия вдоль ДК, ×100.

2, а; 3, а), а также применяли комбинированную ШИК-реакцию в сочетании с альциановым синим. Иммуногистохимическое исследование проводили с помощью иммуностейнеров Leica Bond-maX (Германия) и Ventana Beuch Mark Ultra (США). Иммуногистохимическая панель включала антитела к Muc 2 (клон Сср58), Muс 5АС (клон CLH2) и Muc 6 (клон MRQ-20). Интерпретацию иммуногистохимического исследования с указанными антителами проводили по двум критериям: а) количественным — путем подсчета количества окрашенных опухолевых клеток на 100 клеток в 10 полях зрения (увеличение 400), выражали полученные результаты в процентах с формированием трех групп: 0-я — отсутствие окрашенных клеток, 1-я — до 50% окрашенных клеток (очаговая), 2-я — более 50% окрашенных клеток; б) полуколичественным — интенсивность экспрессии антител в опухолевых клетках оценивали по балльной шкале от 0 до 3: 0 — отсутствие реакции, 1 — слабая реакция (светло-коричневое окрашивание), 2 — умеренная реакция (коричневое окрашивание), 3 — сильная реакция (темно-коричневое окрашивание).

Для выявления мутаций генов KRAS и BRAF использовали парафиновые блоки с зубчатыми образованиями (см. табл. 1), из которых была выделена геномная ДНК (набор для выделения ДНК DNA Sample Preparation Kit, «Cobas Roche», СШA).

Для определения мутаций генов KRAS и BRAF использовали метод ПЦР в режиме реального времени (ПЦР РВ), набор реагентов KRAS/BRAF Mutation Analysis Kit («EntroGen», СШA); аналитическая панель включала мутации 2,3,4 экзона гена KRAS и мутацию гена BRAFp.V600E. Исследование проводилиь на термоциклере C1000 Touch с оптическим модулем CFX96 («Bio-RadLaboratories», США). Данные прогонов обрабатывали с использованием программы CFX Manager v2.1.

Статистическую обработку данных выполняли в программах MS Excel и Statistica 10.0. Перед началом работы методом Колмогорова—Смирнова провели анализ цифровых данных на нормальность распределения. Для статистической обработки данных использовали методы непараметрической статистики. Сравнение групп проводили методом дисперсионного анализа Kruskal—Wallis «multiple comparisons of mean ranks for all groups». Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

Генетическое и иммуногистохимическое исследование СЗА с антителами к Muc 2, Muc 6 и Mu с 5АС

При генетическом исследовании СЗА мутация гена BRAF выявлена в 53,8% случаев, в 46,2% мутация не обнаружена (см. табл. 1, 2).

Таблица 2. Количество случаев, исследованных на наличие мутаций генов BRAF и KRAS относительно экспрессии Muc 2, 5AC, 6

Цитоплазматическую выраженную экспрессию Muc 2 выявляли вдоль ДК СЗА в 84,6% (см. рис. 1, б, табл. 2). В части СЗА (15,4%) преобладала умеренная экспрессия, которая преимущественно локализовалась в основаниях крипт (ОК). В большинстве случаев (85,7%) с наличием мутации гена BRAF диагностировали выраженную экспрессию к Muc 2; в остальных случаях (14,3%) — очаговую умеренную экспрессию. В то время как в СЗА без мутации гена BRAF в 50% случаев выявляли умеренную экспрессию в ОК и в 50% — выраженную реакцию (вдоль ДК).

При исследовании СЗА с муцином желудочного типа Muc 6 выраженная реакция маркера локализовалась в дилатированных ОК и вдоль крипты в 76,9% (см. рис. 1, в, табл. 2), также выявлена очаговая умеренная реакция в ОК в 19,2%, в 1 (3,8%) случае отсутствовала экспрессия маркера. Во всех наблюдениях с мутацией гена BRAF в СЗА выявляли выраженную экспрессию Muc 6, локализованную в дилатированных ОК и вдоль ДК. В случаях СЗА без мутации диагностировали очаговую выраженную (50%) и умеренную (41,6%) экспрессию к Muc 6, в 8,4% наблюдений экспрессия указанного маркера отсутствовала (см. табл. 2).

При иммуногистохимическом исследовании с антителами к желудочному типу муцина Muc 5AC в большинстве случаев (53,8%) определяли выраженную реакцию. В 30,8% случаев присутствовала выраженная очаговая экспрессия вдоль ДК (см. рис. 1, г, табл. 2), в 15,4% отсутствовала реакция с маркером к Muc 5AC.

В группе СЗА с мутацией гена BRAF во всех случаях отметили выраженную цитоплазматическую экспрессию антител к Muc 5AC вдоль ДК. В то время как в группе без мутации гена BRAF в 66,7% выявляли очаговую умеренную экспрессию вдоль ДК; в 33,3% экспрессия Muc 5AC отсутствовала (см. табл. 2).

При статистическом анализе СЗА с наличием и без мутации гена BRAF статистически значимых различий в экспрессии Muc 2, Muc 5AC и Muc 6 не получено (р>0,05).

Генетическое и иммуногистохимическое исследование ГП с антителами к Muc 2, Muc 6 и Mu с 5АС

При генетическом исследовании ГП выявлены мутации гена BRAF в 38,5% случаев и гена KRAS в 15,4%, в 46,2% случаев отсутствовали мутации генов (см. табл. 1).

В ГП отмечена выраженная цитоплазматическая экспрессия маркера к Muc 2, которую определяли во всех случаях, она локализовалась равномерно вдоль ДК; различий в группе с мутациями генов BRAF, KRAS и без них не обнаружено (р>0,05) (см. рис. 2, б,

Рис. 2. Гиперпластический полип (микровезикулярный подтип) толстой кишки. а — гистологическая картина зубчатого профиля поверхностного эпителия и вдоль ДК, большое количество бокаловидных клеток. Окраска гематоксилином и эозином, ×100; иммуногистохимическое исследование ГП с антителами: б — к Muc 2 — выявлена выраженная экспрессия вдоль ДК и в поверхностном эпителии, ×100; в — к Muc 6 — отсутствие экспрессии, ×100; г — к Muc 5AC — единичные окрашенные эпителиоциты, ×100.

табл. 2).

В ГП в большинстве (92,3%) исследованных случаев реакция с антителами к Muc 6 была негативной (см. рис. 2, в, см. табл. 2), однако в 7,7% определялась умеренная очаговая экспрессия в О.К. Во всех случаях с наличием мутаций генов реакция отсутствовала. Экспрессия Muc 6 в ОК отмечена в ГП без мутаций генов в 16,6%.

Положительная выраженная реакция с антителами к Muc 5AC выявлена во всех случаях ГП, однако реакция была очаговой и неравномерной вдоль ДК (см. рис. 2, г, табл. 2). Так же как и с антителами к Muc 2, особенностей в экспрессии Muc 5AC в ГП с наличием и без мутаций генов BRAF и KRAS не было (р>0,05).

Генетическое и иммуногистохимическое исследование ТЗА с антителами к Muc 2, Muc 6 и Mu с 5АС

По результатам генетического исследования выявлено, что в 53,8% ТЗА имеется мутация гена KRAS, а в 46,2% мутация генов отсутствует (см. табл. 1).

При иммуногистохимическом исследовании с антителами к Muc 2 отмечена выраженная реакция вдоль ДК и в эктопированных участках, в некоторых случаях — очаговая реакция вдоль ДК (см. рис. 3, б).

Рис. 3. Традиционная зубчатая аденома толстой кишки. а — гистологическая картина зубчатого профиля в верхней части крипт, множественные перпендикулярно отходящие выросты. Окраска гематоксилином и эозином, ×100; иммуногистохимическое исследование ТЗА с антителами: б — к Muc 2 выявлена выраженная экспрессия вдоль ДК и в поверхностном эпителии, ×100; в — к Muc 6 — отсутствие экспрессии, ×100; г — к Muc 5AC — выраженная экспрессия в поверхностном эпителии и в верхней части крипт, единичные окрашенные эпителиоциты в нижних отделах, ×100.

Во всей группе ТЗА с мутацией гена KRAS сохранялась выраженная экспрессия маркера вдоль ДК. В группе ТЗА без мутации гена KRAS в 50% выявлена умеренная очаговая экспрессия вдоль ДК, в другой половине — выраженная экспрессия вдоль ДК (см. табл. 2).

Реакция с антителом к Muc 6 отсутствовала во всех случаях ТЗА как в группах с наличием мутации гена KRAS, так в группе без выявленных мутаций (см. рис. 3, в, см. табл. 2).

Экспрессия Muc 5AC отмечена очагово с расположением в верхней части крипты и поверхностном эпителии в большей (61,6%) части ТЗА, в 38,4% реакция отсутствовала (см. рис. 3, г, табл. 2). При этом очаговая экспрессия встретилась во всех случаях с мутацией гена KRAS, в 1 (16,7%) наблюдении без мутации. В остальных случаях без мутации реакция с антителами к Muc 5AC была негативной (83,3%).

Однако статистически значимых различий в экспрессии маркеров Muc 2 и Muc 5AC среди случаев ТЗА с наличием и без мутаций гена KRAS не получено (р>0,05).

Обсуждение

Полученные в ходе исследования результаты во многом согласуются с данными литературы. Особенно интересны выявленные различия в группах зубчатых аденом с наличием и без мутаций генов BRAF и KRAS. Так, подробно описаны особенности экспрессии Muc 2 в СЗА, ГП и ТЗА с акцентом в подгруппах с наличием и без мутаций генов. По данным литературы [10, 11, 15—17], известно, что экспрессия Muc 2 повышается при прогрессировании злокачественного процесса в муцинпродуцирующих опухолях толстой кишки, а также более часто встречается в зубчатых аденомах с мутацией гена BRAF. По результатам исследования в СЗА с мутацией гена BRAF выявляется более яркая реакция в 85,7%, чем в СЗА без мутации, что согласуется с имеющимися данными. Однако для ГП выраженная реакция характерна для всех случаев (с мутацией и без генов BRAF и KRAS). В ТЗА выявлена только мутация гена KRAS, и в этих случаях реакция к Muc 2 была выраженная вдоль ДК, в то время как без мутации гена KRAS в половине случаев отмечена выраженная экспрессия вдоль ДК, в другой половине — умеренная экспрессия в ОК. В существующей литературе подобных данных по ТЗА не найдено. Положительная экспрессия Muc 6 выявлена в 100% СЗА и отрицательная — в 100% в ГП с наличием мутации гена BRAF. В ТЗА с мутацией гена KRAS экспрессия Muc 6 оказалась отрицательной. Однако, по данным других исследователей [19], в ТЗА обнаружена положительная экспрессия Muc 6. Полученные результаты экспрессии желудочного маркера к Muc 5AC во многом согласуются с имеющимися сведениями других исследователей [11, 18, 24]. Мы подробно описали экспрессию данного маркера для всех трех типов зубчатых аденом толстой кишки (см. табл. 2) с учетом наличия или отсутствия мутаций генов BRAF и KRAS.

Заключение

Проведенное исследование демонстрирует различную иммуногистохимическую реакцию с антителами к Muc 2, Muc 5АС и Muc 6: экспрессия зависит как от типа зубчатого образования толстой кишки, так и от наличия/отсутствия мутаций генов BRAF и KRAS, что может быть применимо в практическом здравоохранении с целью проведения их дифференциальной диагностики.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Л.М.М., Е.Д.Ф.

Сбор и обработка материала — Р.А.В., А.Е.Б., К.Ю.М.

Статистическая обработка — Н.К.Ш., В.В.П.

Написание текста — Р.А.В., А.Е.Б.

Редактирование — Л.М.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Михалева Людмила Михайловна — д-р мед. наук, проф., зав. лабораторией клинической морфологии; e-mail: mikhalevalm@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-2052-914X

Бирюков А.Е., https://orcid.org/0000-0001-9700-3352

Шахназян Н.К., https://orcid.org/0000-0003-3386-7746