Соловьева С.Е.

Отдел хирургии пороков сердца Российского научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского, Москва, Россия

Пальцева Е.М.

Лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития России

Морозова М.М.

Отделение хирургии пороков сердца Российского научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Каабак М.М.

Отделение трансплантации почки Российского научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Крайник Н.А.

ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского», Москва, Россия

Матвеев А.В.

Кафедра оперативной и клинической хирургии Тихоокеанского государственного медицинского университета, Владивосток

Клинико-морфологические признаки вирусного поражения почечного трансплантата

Журнал: Архив патологии. 2017;79(2): 22-28

Просмотров : 209

Загрузок : 5

Как цитировать

Соловьева С. Е., Пальцева Е. М., Морозова М. М., Каабак М. М., Крайник Н. А., Матвеев А. В. Клинико-морфологические признаки вирусного поражения почечного трансплантата. Архив патологии. 2017;79(2):22-28.
Solovyova S E, Pal'tseva E M, Morozova M M, Kaabak M M, Krainik N A, Matveev A V. Clinical and morphological signs of viral damage to a kidney transplant. Arkhiv Patologii. 2017;79(2):22-28.
https://doi.org/10.17116/patol201779222-28

Авторы:

Соловьева С.Е.

Отдел хирургии пороков сердца Российского научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского, Москва, Россия

Все авторы (6)

В последние годы в развитых странах возросла частота встречаемости оппортунистических вирусных инфекций, что связывают в первую очередь с активным применением иммуносупрессивной терапии, сопутствующей трансплантации различных органов, в том числе трансплантации почек. По данным серологических исследований от 50% (аденовирусы) до 90% (полиомавирус, герпесвирусы) населения имеют антитела к оппортунистическим вирусам, инфицирование происходит еще в детском возрасте, после чего заболевание в большинстве случаев протекает у иммунокомпетентных пациентов бессимптомно или вызывает легкие инфекции, приобретающие затем латентное течение. Однако для иммунокомпрометированных лиц они представляют серьезную опасность, особенно когда речь идет о детской популяции [1—3].

Аденовирусы — семейство двухцепочечных безоболочечных литических ДНК-содержащих вирусов, подразделяющихся на 6 групп и более чем на 50 серотипов. Аденовирусная инфекция в почечном трансплантате встречается довольно часто, особенно в первые месяцы после трансплантации [1, 4—8]. Стоит отметить, что аденовирусы имеют механизмы уклонения от иммунного ответа, такие как ингибиция функции интерферонов с помощью вирусассоциированной РНК и гена E1A, ингибиция внутриклеточного апоптоза в инфицированных клетках и предотвращение экспрессии антигенов большого комплекса гистосовместимости класса 1 на клеточной поверхности [1].

Полиомавирус — распространенный вирус семейства Papovaviridae, доля серопозитивных лиц в общей популяции достигает 60—100%. Первичное инфицирование обычно происходит в детском возрасте, также подтверждена возможность переноса вируса с донорским органом. Полиомавирусы способны приводить к полиомавирусной нефропатии трансплантата (PVN), чаще всего вызванной двумя штаммами вируса: BK-вирусом и реже JC-вирусом [6].

Герпесвирусы — семейство ДНК-содержащих вирусов, включающее α-герпесвирусы (HSV-1, HSV-2), β-герпесвирусы (цитомегаловирус) и γ-герпесвирусы (вирус Эпштейна—Барр).

Распространенность HSV очень высока — инфекция поражает до 95% людей во всем мире. Как и все герпесвирусы, после первичного инфицирования HSV способен латентно персистировать в организме, возобновляя продуцирование вирусных частиц при снижении иммунитета. Первичная HSV-инфекция редко встречается у реципиентов почечного трансплантата. Наиболее часто отмечается реактивация вируса, не сопровождающаяся развитием клинической симптоматики, встречается информация о возможности диссеминации возбудителя с вовлечением внутренних органов, однако подобные случаи чрезвычайно редки [1].

Цитомегаловирус (CMV) — двухцепочечный ДНК-содержащий вирус, после первичной инфекции латентно персистирующий в миелоидных клетках-предшественниках. Частота вирусоносительства в странах Восточной Европы более 80—85% [6]. У пациентов с трансплантированными органами выделяют CMV-инфекцию — репликацию вируса без клинических симптомов и CMV-болезнь — репликацию CMV в сочетании с симптомами заболевания. CMV-инфекция занимает ведущее место среди вирусных инфекций у пациентов после пересадки органов как по частоте, встречаясь у 30—80% пациентов, так и по тяжести проявлений. Максимальный риск развития СМV-инфекции приходится на первые полгода после трансплантации с пиком заболеваемости между 2-м и 3-м месяцем. Основными факторами риска CMV-болезни для реципиентов трансплантата являются: трансплантация органа от серопозитивного донора к серонегативному реципиенту, усиление режима иммуносупрессии, а также применение препаратов антилимфоцитарных антител [6, 9, 10].

Вирус обладает иммуномодулирующими свойствами. Репликация CMV индуцирует иммуносупрессивное состояние за счет функциональных изменений в лимфоцитах и моноцитах. CMV-инфекция также связана с активацией других герпесвирусов, таких как HSV, вирус Варицелла—Зостер, Эпштейна—Барр или вирусы герпеса человека (HHV 6, 7, 8) [9].

Вирус Эпштейна–Барр (EBV) — двухцепочечный ДНК-содержащий вирус, существующий в клетках в латентной или литической фазе. EBV может инфицировать В- и Т-лимфоциты, эпителиальные, гладкомышечные и фолликулярные дендритные клетки. Вирусный геном сохраняется в небольшой части В-лимфоцитов в течение всей жизни. Поскольку 90% взрослого населения имеют антитела к EBV, симптоматическая инфекция наиболее часто встречается у нативных по данному вирусу детей. EBV связан с развитием посттрансплантационного лимфопролиферативного заболевания (ПТЛЗ) и широким спектром злокачественных новообразований [6, 11—13].

Почти все реципиенты инфицированы или в итоге станут инфицированы EBV, но только у некоторых из них разовьется ПТЛЗ. Среди факторов риска ПТЛЗ выделяют EBV-серонегативность или активную первичную EBV-инфекцию на момент трансплантации, спленэктомию в анамнезе, повторную трансплантацию, пожилой и детский возраст, сочетание с CMV и другими вирусными инфекциями, реакцию трансплантат против хозяина, режим иммуносупрессии и др. [6, 12].

Активации вирусов после трансплантации способствуют многочисленные факторы, такие как иммуносупрессия (особенно снижение цитотоксического иммунитета), последствия лечения отторжения трансплантата и сочетанная репликация вирусов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Кроме того, реакция реципиента менее эффективна из-за несоответствия основных антигенов гистосовместимости, что снижает эффективность прямого пути противовирусного клеточного иммунного ответа и повышает восприимчивость к вирусным инфекциям. Вирусная инфекция может быть первичной, реактивацией персистирующего вируса, а также передаваться реципиенту через донорский орган. При трансплантации почек риск развития тяжелых жизнеугрожающих осложнений и потери трансплантата наиболее высок в первые месяцы после трансплантации, в период подбора иммуносупрессивной терапии [1, 2, 4—6].

Актуальность изучения вирусных инфекций трансплантата обусловлена не только повсеместным распространением оппортунистических инфекций, но и способностью многих вирусов, например аденовирусов и CMV, оказывать модулирующее действие на иммунный ответ хозяина, способствуя персистенции вируса либо провоцируя реакцию отторжения [1]. Отношения между вирусными инфекциями и развитием отторжения аллотрансплантата остаются спорными, однако имеются данные о прямой и косвенной связи этих процессов [4]. Учитывая нередкое отсутствие характерной морфологической картины вирусного поражения и возможность сочетанного течения инфекций, представляется важным комплексный клинико-морфологический подход к оценке диагностических биоптатов трансплантатов [1].

Цель настоящего исследования — сопоставление картины морфологических изменений и результатов определения ряда вирусов в биоптатах с клиническими проявлениями у реципиентов почечных трансплантатов.

Материал и методы

Клинико-морфологическое исследование проведено на диагностическом материале 71 пункционной биопсии почечных трансплантатов, полученных от 61 пациента (от 2 до 63 лет, медиана возраста 20 лет), проходивших лечение в РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского в период с 2004 по 2016 г. В качестве контрольной группы использовались биоптаты 10 собственных почек, которые были получены при нефрэктомии.

Материал пункционных биопсий фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,4), осуществляли проводку на гистопроцессоре и заливали в парафин. Для гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) исследования изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм. Для гистологического исследования биоптатов почечных трансплантатов использовали окраску гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, PAS-реакцию. Депарафинирование и ИГХ-исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica») c первичными мышиными моноклональными антителами к аденовирусу («Abcam», клон М58+М73; разведение 1:100), цитомегаловирусу рр56 («Abcam», клон 2+6; разведение 1:400), ядерному антигену вируса Эпштейна—Барр («Abcam», клон Е1−2.5; разведение 1:3000), вирусу герпеса I типа («Сell Marque», клон 10А3; разведение 1:800) и поликлональными кроличьими антителами к вирусу герпеса II типа («Сell Marque», поликлональные; разведение 1:600).

Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Оценку морфологической картины проводили в соответствии с критериями Banff-классификации. Экспрессию вирусных частиц определяли в цитоплазме клеток и оценивали полуколичественным методом: +++ — выраженная, ++ — умеренная, + — слабая, (–) и (+/–) — отрицательная и незначительная экспрессия. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру (Leica СTR 5000).

Проводили сопоставление клинических данных, таких как наличие вирусов в моче (полиомавирус) и крови (полиомавирус, цитомегаловирус, вирус Эпштейна—Барр), уровень креатинина, протеинурия, значения АД, заключения УЗИ, родственный и трупный тип трансплантата, пол и возраст пациентов, с морфологической и ИГХ-картиной.

Для статистической обработки данных применяли метод Пирсона χ2, точный метод Фишера. Статистическую значимость принимали при p<0,05.

Результаты и обсуждение

По результатам морфологического и ИГХ-исследования вирусный нефрит наблюдался в 37 (52,1%) случаях, острое отторжение и пограничные изменения в трансплантате — в 12 (16,9%), сочетание пограничных изменений с вирусным нефритом — в 15 (21,1%), вирусные частицы без морфологических признаков нефрита — в 7 (9,9%) случаях. В 52 (73,2%) случаях выявлена экспрессия антигенов аденовируса, в 40 (56,3%) случаях — вируса герпеса I типа, в 1 (1,4%) случае — цитомегаловируса, экспрессия вируса герпеса II типа в 8 (11,2%) случаях была оценена как незначительная (табл. 1).

Таблица 1. Экспрессия вирусов в биоптатах почечных трансплантатов (n=71)

Достоверно чаще морфологические проявления нефрита отмечались у пациентов с выявлением аденовирусных антигенов ИГХ-методом (p<0,05) (рис. 1, а, б, табл. 2). Выраженная экспрессия аденовируса наблюдалась у 4 пациентов, умеренная — у 24, слабая — также у 24, незначительная — у 13 пациентов, у 6 человек экспрессия отсутствовала. При сравнении исследуемой группы с группой контроля экспрессия антигенов аденовируса достоверно чаще (p<0,05) выявлялась у пациентов после трансплантации, что подтверждает влияние иммуносупрессивной терапии на активацию аденовирусной инфекции (табл. 3).

Таблица 2. Морфологические проявления нефрита у пациентов с выявлением аденовирусных антигенов

Таблица 3. Экспрессия аденовируса у пациентов после назначения иммуносупрессивной терапии по сравнению с контрольной группой Примечание. * — р<0,05.

Рис. 1. морфологические изменения при аденовирусном нефрите и экспрессия вирусных частиц. а, б — частицы аденовируса в эпителии почечных канальцев, иммуногистохимическое окрашивание, ×200 и 400; в — изменения ядер, воспалительная инфильтрация интерстиция, кровоизлияния, гранулемоподобные структуры; г — очаги некроза и регенераторные изменения эпителия канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. ×400.

При морфологическом исследовании основными признаками аденовирусного нефрита являлись наличие внутриядерных включений вирусных телец; повреждение эпителия канальцев с разрушением базальных мембран и фокусами некроза; мононуклеарная и плазмоцитарная клеточная инфильтрация в отдельных случаях с формированием гранулем; фокальные интерстициальные кровоизлияния и внутриканальцевые скопления эритроцитов (см. рис. 1, в, г).

Особенностью аденовирусного нефрита, затрудняющей морфологическую и ИГХ-диагностику, являются очаговый характер вирусного поражения паренхимы, а также большое количество серотипов аденовирусов (более 50) [1, 5, 6, 8], которое может приводить к ложноотрицательным результатам при ИГХ-диагностике: в нашем исследовании у 3 пациентов с характерной морфологической картиной аденовирусного нефрита антитела выявлены не были.

У пациентов с иммуносупрессией по сравнению с иммунокомпетентными лицами отмечается более пролонгированная, тяжелая, иногда приводящая к летальным последствиям аденовирусная инфекция. Наиболее тяжелое течение аденовирусной инфекции чаще наблюдается в раннем посттрансплантационном периоде, сопровождающемся интенсивной иммуносупрессивной терапией [5], преимущественно у детей до 5 лет (по некоторым данным, до 9), что в первую очередь связывают с возможностью первичного инфицирования и несформированностью детского иммунитета [1, 3, 4, 8]. Результаты нашего исследования подтвердили связь возраста пациентов и сроков после трансплантации почки с тяжестью вирусного поражения: из 37 случаев вирусного нефрита потеря трансплантата отмечалась у 4 детей от 2 до 6 лет и 1 взрослого пациента, причем у детей потеря трансплантата наступала в первые месяцы после операции (p<0,05) (табл. 4, 5), что согласуется с данными многочисленных исследований [1, 3, 4, 8, 14—16].

Таблица 4. Связь возраста пациентов с потерей трансплантата

Таблица 5. Связь срока после трансплантации с потерей трансплантата Примечание. * — р<0,05.

При УЗИ, предшествовавшем потере трансплантатов у пациентов с вирусным нефритом, у 4 из 5 пациентов отмечались выраженные изменения: утолщение коркового слоя, у некоторых с увеличением толщины трансплантата; снижение пиковой систолической скорости на уровне всех почечных сосудов, диастолический кровоток был значительно снижен или отсутствовал вплоть до отрицательной диастолы. У 1 из пациентов ультразвуковая картина более всего соответствовала острому отторжению. УЗИ наглядно демонстрирует патологические изменения трансплантата, однако специфических эхо- и допплерографических признаков поражения трансплантата вирусом выявить не позволяет.

Дифференциальная диагностика аденовирусного нефрита проводилась с прочими типами вирусных инфекций, в первую очередь с полиомавирусной нефропатией (PVN), которым не свойственны преобладание таких изменений, как деструкция канальцев с формированием фокусов некроза и разрушением базальных мембран, гранулематозное воспаление с палисадным расположением макрофагов вокруг пораженных канальцев и кровоизлияния в интерстиций [5—7].

Хотя пункционная биопсия трансплантата является золотым стандартом диагностики PVN, выявляя специфическую морфологическую картину при типичном течении инфекции, на ранних стадиях заболевания постановка диагноза при гистологическом исследовании может представлять сложность [6, 17—20]. Для уточнения диагноза в нашем исследовании использовался метод ПЦР, с помощью которого ВК-вирус был выявлен у 10 пациентов: характерная морфологическая картина PVN с очагами некроза канальцевого эпителия, наличием внутриядерных аморфных базофильных включений матово-стекловидных телец (рис. 2, а, б), интерстициальным воспалением и склерозом коркового и мозгового слоев наблюдалась в 4 биоптатах от 3 из этих пациентов, что согласуется с высокой чувствительностью ПЦР, позволяющей определять слабую репликацию вируса, еще не сопровождающуюся гистологическими изменениями [11]. Также отсутствие специфических признаков PVN у этих пациентов может объясняться возможностью очагового поражения паренхимы.

Рис. 2. Морфологические изменения при полиомавирусной нефропатии. а, б — изменения ядер (увеличение, гиперхромия, внутриядерные включения), воспалительная инфильтрация. окраска гематоксилином и эозином. ×400 и 1000.

ПЦР также является ведущим методом мониторинга, проводимого у реципиентов трансплантата для предотвращения развития CMV-болезни. Выявление репликации CMV методом ПЦР не обязательно сопровождается морфологическими изменениями — благодаря своевременной диагностике и профилактике значительно чаще встречается бессимптомная CMV-инфекция [9]. В данном исследовании при ПЦР наличие ДНК CMV выявлено у 9 пациентов, у 1 из них отмечена иммуногистохимическая картина CMV-нефрита, сочетавшаяся с неспецифическими морфологическими проявлениями нефрита. Цитопатические изменения с внутриядерными, так называемый глаз совы, и цитоплазматическими включениями в клетках эпителия канальцев и эндотелия сосудов у данного пациента не наблюдались.

Определение ДНК вируса EBV в настоящее время входит в рутинную медицинскую практику с целью своевременной диагностики и прогнозирования развития ПТЛЗ у реципиентов трансплантата. В то время как у многих здоровых реципиентов трансплантата выявляется низкий уровень вирусной нагрузки, высокая вирусная нагрузка EBV тесно связана с текущим или вероятным развитием ПТЛЗ. Диагноз ПТЛЗ при биопсии трансплантата достаточно сложен, в связи с чем актуально использование таких методов, как ПЦР и ИГХ [6, 11, 12, 21]. В текущем исследовании морфологических признаков EBV отмечено не было, при ИГХ-исследовании в 100% случаев наблюдалось наличие ядерного антигена вируса Эпштейна—Барр, что подтверждает широкое распространение латентно персистирующего вируса, при ПЦР ДНК вируса EBV с низкой вирусной нагрузкой была выявлена у 5 пациентов.

Трактовку роли герпесвирусов в развитии нефрита осложняло сочетанное выявление антител к аденовирусам у большинства пациентов с HSV-инфекцией. При ИГХ-исследовании экспрессия антител к HSV-1 от слабой до значительной обнаружена в 40 (56,3%) биоптатах, в 8 (11,2%) биоптатах определялась незначительная экспрессия HSV-2, однако достоверная связь выявления HSV-1 и HSV-2 с развитием морфологических изменений установлена не была (p>0,05).

Протеинурия и повышение уровня креатинина выявлены как у пациентов с вирусным нефритом (в 13 и 32 случаях соответственно), так и без него (в 3 и 9 случаях), причем в обеих группах встречались пациенты с реакцией отторжения и хронической трансплантационной гломерулопатией, что не позволило отнести подобные изменения к специфичным для вирусного поражения трансплантата и говорить о наличии достоверной связи (p>0,05).

Родственный либо трупный тип трансплантата не повлиял на развитие нефрита и частоту потери трансплантата (p>0,05). Не была также обнаружена связь пола пациентов с развитием вирусного нефрита (p>0,05). Оценка значений артериального давления оказалась малоинформативной в связи с назначением пациентам гипотензивных препаратов.

Заключение

В нашем исследовании экспрессия антигенов аденовируса чаще выявлялась у пациентов с посттрансплантационным нефритом, чем у реципиентов без нефрита или в контрольной группе, что подтвердило актуальность применения ИГХ-метода для выявления вирусного нефрита. Отмечен риск тяжелого течения вирусного нефрита с возможностью потери трансплантата у пациентов младшего возраста в ранние (первые месяцы) сроки после трансплантации. Потере трансплантата предшествовали выявленные при УЗИ изменения гемодинамических показателей и утолщение коркового слоя. ПЦР подтвердила наличие полиомавируса у пациентов с морфологической картиной полиомавирусной нефропатии. Таким образом, учитывая разнообразие факторов, влияющих на течение инфекции в почечном трансплантате, при подозрении на вирусный нефрит целесообразно сочетать морфологическое исследование с иммуногистохимическим и оценкой клинических данных.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.М.К., Е.М.П.

Сбор и обработка материала: С.Е.С., Е.М.П., М.М.М., Н.А.К., А.В.М.

Статистическая обработка: С.Е.С.

Написание статьи: С.Е.С., Е.М.П.

Редактирование: Е.М.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail