Новикова М.В.

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Рыбко В.А.

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Кочатков А.В.

Институт хирургии им. А.В. Вишневского, Москва

Хромова Н.В.

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Богомазова С.Ю.

Лечебно-реабилитационный центр Министерства здравоохранения и социального развития РФ, Москва

Дугина В.Б.

НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва, Россия

Лядов В.К.

ФГБУ «Лечебно-реабилитационный центр» Минздрава России, Москва, Россия

Копнин П.Б.

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Изменение экспрессии мембраноассоциированных белков и цитоплазматических изоформ актина при прогрессировании опухолей толстой кишки человека

Журнал: Архив патологии. 2017;79(2): 15-21

Просмотров : 229

Загрузок : 4

Как цитировать

Новикова М. В., Рыбко В. А., Кочатков А. В., Хромова Н. В., Богомазова С. Ю., Дугина В. Б., Лядов В. К., Копнин П. Б. Изменение экспрессии мембраноассоциированных белков и цитоплазматических изоформ актина при прогрессировании опухолей толстой кишки человека. Архив патологии. 2017;79(2):15-21.
Novikova M V, Rybko V A, Kochatkov A V, Khromova N V, Bogomazova S Iu, Dugina V B, Lyadov V K, Kopnin P B. A change in the expression of membrane-associated proteins and cytoplasmic actin isoforms in the progression of human colon tumors. Arkhiv Patologii. 2017;79(2):15-21.
https://doi.org/10.17116/patol201779215-21

Авторы:

Новикова М.В.

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Все авторы (8)

Важным этапом прогрессии эпителиальных опухолей является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), приводящий к утрате эпителиальной дифференцировки и повышению миграционной способности клеток [1]. Данный процесс характеризуется разрушением адгезионных межклеточных контактов (с нарушением локализации и экспрессии Е-кадгерина и β-катенина) и повышением продукции мезенхимальных маркеров [2—8]. Такие клетки приобретают локомоторный фенотип [9], что повышает их способность к инвазии и метастазированию [10]. Повышенная подвижность опухолевых клеток связана с динамической реорганизацией цитоскелета и адгезионных структур [11]. В немышечных клетках актиновый цитоскелет представлен двумя функционально различными цитоплазматическими изоформами β и γ [12, 13]. β-Актин преобладает в стресс-фибриллах, кольцевых пучках, сократительных митотических кольцах и в зонах адгезионных межклеточных контактов, γ-актин образует кортикальную сеть, а также связан с плотными контактами [13, 14]. Ранее нами было показано, в том числе и на модели опухоли толстой кишки, что смещение баланса цитоплазматических актинов за счет уменьшения доли β-актина может приводить к ЭМП и усилению злокачественных характеристик опухолевых клеток [15].

Целью настоящей работы явилось выявление корреляций между клиническими характеристиками, уровнем риска прогрессии и рецидивирования аденокарцином толстой кишки (АТК) человека и опухолевыми маркерами, ассоциированными с ЭМП.

Материал и методы

Образцы опухолей

Материалом послужили образцы опухолевой ткани пациентов, оперированных в отделении хирургической онкологии ФГАУ «Лечебно-реабилитационный центр» Минздрава России с/без предварительной химиотерапии в 2014—2015 гг. В ходе исследования проанализировано 50 образцов АТК. Стадирование распространенности опухолевого процесса проводили в соответствии с классификацией TNM 7-го пересмотра. В качестве контроля (нормы) анализировали образец условно нормальной ткани (слизистого слоя кишки) того же пациента.

По прогнозу течения заболевания больных стратифицировали в 4 группы в соответствии с критериями, предложенными L. Gunderson и соавт. [16]: с низким, промежуточным, умеренно высоким и высоким риском развития рецидива заболевания после радикального лечения (табл. 1).

Таблица 1. Критерии определения риска рецидивирования и/или прогрессии (по L. Gunderson и соавт. [16]) Высокий

Иммуногистохимия и флюоресцентная микроскопия

Для исследования использованы архивные образцы фиксированного формалином парафинового материала. Срезы депарафинировали, демаскировку антигенов проводили в растворе 0,01 M трис/0,001M ЭДTA; pH 9,0, в течение 20 мин при 95 °C. Срезы инкубировали со следующими антителами: мышиными, моноклональными к β-актину (MCA5775GA, «AbD Serotec»), γ-актину (MCA5776GA, «AbD Serotec»), Е-кадгерину (205602, «Calbiochem»), кавеолину-1 (AF5736, «R&D Systems») и β-катенину (М3539, «Dako»). В качестве вторых антител использованы антимышиные антитела козы, конъюгированные с флюорохромами AlexaFluor488, AlexaFluor546 («Invitrogen»). Образцы анализировали с помощью микроскопа Axioplan с использованием объектива 40х/0.75 Plan-Neofluar («Carl Zeiss», Германия). Оценку интенсивности флюоресценции проводили с помощью программы Image J. Интенсивность флюоресценции опухолевых клеток была нормирована относительно фона и сравнивалась с флюоресценцией условно-нормальных клеток слизистого слоя толстой кишки того же пациента.

Статистический анализ

Сначала был проведен предварительный скрининг и дана характеристика образцов, относящихся к различным группам (стадиям) заболевания (табл. 1, 2, 3, 4, 5, 6). Первичный отбор признаков для дальнейшей статистической обработки проводился по данным количественной оценки снижения/повышения экспрессии белков-маркеров. Результаты иммунофлюоресцентного анализа представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего по результатам как минимум трех независимых экспериментов (случаев) для каждого значения G (табл. 7). Результаты оценки наиболее перспективных маркеров проанализированы для каждой группы попарно по сравнению с предыдущей группой с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Проанализированные данные исследований представлены на диаграммах как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для каждой группы данных. Значения p<0,05 и p<0,01 считались статистически достоверными для выявления различий в расположении двух выборок.

Таблица 2. Распределение образцов в зависимости от морфологических и прогностических критериев

Таблица 3. Распределение образцов в зависимости от критерия Т

Таблица 4. Количество образцов опухолей с выявленными молекулярными нарушениями в опухолевых клетках в зависимости от уровня риска Примечание. 1 — снижение экспрессии β-актина; 2 — гиперэкспрессия γ-актина; 3 — нарушение локализации и/или снижение экспрессии Е-кадгерина; 4 — нарушение локализации и/или снижение экспрессии β-катенина; 5 — нарушение локализации и/или снижение экспрессии кавеолина-1; 6 — среднее количество молекулярных нарушений в опухолевых клетках по сравнению с нормальными эпителиальными клетками слизистого слоя толстой кишки (в процентах).

Таблица 5. Количество образцов опухолей с выявленными молекулярными нарушениями в зависимости от дифференцировки (Grade)

Таблица 6. Количество образцов опухолей с выявленными молекулярными нарушениями в зависимости от степени инвазии (критерия T)

Таблица 7. Количественная оценка снижения экспрессии β-актина в опухолевых клетках по сравнению с нормальным эпителием толстой кишки в зависимости от степени дифференцировки опухолей (%)

Результаты и обсуждение

Молекулярные нарушения в опухолевых клетках

Образцы опухолевой ткани разделены на 4 группы в зависимости от риска развития рецидива или прогрессии заболевания. Отдельно рассматривались опухоли IV стадии (отдаленные метастазы). Все образцы оценены по степени дифференцировки (Grade: G1, G2 и G3 — высоко-, умеренно- и низкодифференцированные соответственно), как показано в табл. 2, и по критерию Т(табл. 3).

В табл. 4 приведены значения количественного соотношения образцов опухолей с молекулярными нарушениями в зависимости от риска развития рецидива и/или прогрессии заболевания после хирургического удаления первичной опухоли. Среднее количество случаев изменения экспрессии выбранных маркеров рассчитывали как отношение образцов с измененной экспрессией маркеров к общему количеству образцов для каждой группы риска.

Как следует из табл. 4, количество молекулярных нарушений в образцах первичных опухолей было минимальным (35%) в группе с низким риском прогрессии заболевания.

Выявление Е-кадгерина, β-катенина и кавеолина-1 в образцах опухолей

В нормальном эпителии либеркюновых крипт и на ранних стадиях опухолевой прогрессии Е-кадгерин локализован в зонах межклеточных контактов, снижение его экспрессии связывают с прогрессией заболевания. При анализе образцов опухолевых тканей обнаружено снижение экспрессии Е-кадгерина и нарушение структуры межклеточных адгезионных контактов по сравнению с нормальной тканью (рис. 1, а, б). В опухолевых клетках части образцов наблюдалось слабое диффузное окрашивание Е-кадгерина в зонах межклеточных контактов и в редких случаях — в цитоплазме. Выраженность таких отклонений увеличивалась на более поздних этапах опухолевой прогрессии (см. рис. 1, в; табл. 5).

Рис. 1. Флюоресцентное ИГХ-окрашивание на Е-кадгерин: образец нормальной (а) и опухолевой ткани (б). Представлены типичные поля зрения, ×400. Процент случаев снижения экспрессии Е-кадгерина в зависимости от G (слева) и Т (справа) относительно общего количества образцов для каждой стадии (в). Флюоресцентное ИГХ-окрашивание на β-катенин: образец нормальной (г) и опухолевой ткани (д, е). Представлены типичные поля зрения, ×400. Флюоресцентное ИГХ-окрашивание на кавеолин-1: образец нормальной (ж) и опухолевой ткани (з). Представлены типичные поля зрения, ×400. Процент случаев снижения экспрессии кавеолина-1 в зависимости от G (слева) и Т (справа) относительно общего количества образцов для каждой стадии (и). Здесь и на рис. 2: статистически значимые различия между группами по тесту Манна—Уитни: * — p<0,05, ** — p<0,01.

Характерные для опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) изменения гена Е-кадгерина (СDH1) приводят к нарушению межклеточных адгезионных контактов, которое сопровождается сменой локализации β-катенина и повышением его транскрипционной активности, в результате чего запускается ряд сигнальных каскадов, стимулирующих деление клеток и увеличение их способности к инвазии [7, 9, 17]. Окрашивание опухолевых образцов выявило снижение мембранной локализации (см. рис. 1, д) и в некоторых случаях ядерную локализацию β-катенина (см. рис. 1, е) в опухолях G2—G3 по сравнению с нормальной тканью (см. рис. 1, г; см. табл. 5). Мы выявили тенденцию к увеличению доли опухолей с измененной локализацией Е-кадгерина по мере увеличения степени инвазии (критерий Т, табл. 6). Интересно отметить, что доля образцов с синхронным нарушением локализации E-кадгерина и β-катенина увеличивалась по мере снижения уровня дифференцировки клеток (50% образцов G3, см. табл. 5).

Кавеолин-1 является одним из ключевых белковых компонентов кавеол (разновидность рафт-структур). Роль кавеолина-1 в канцерогенезе обусловлена его способностью к формированию сигналосом и регуляции пролиферации, миграции и других процессов, важных при злокачественной трансформации клеток. Известно, что изменение экспрессии кавеолина-1 зависит от гистогенетического типа опухоли и стадии заболевания [18]. Поэтому, вероятно, снижение уровня его экспрессии и изменение локализации могут способствовать потере стабильной эпителиальной базоапикальной поляризации и приобретению мезенхимального фенотипа. В ходе исследований мы не выявили ни одного случая нарушения локализации и/или снижения экспрессии белка кавеолин-1 в опухолях с низким уровнем риска прогрессии заболевания (см. табл. 4, см. рис. 1, ж, з); а на более продвинутых стадиях заболевания этот параметр коррелировал с дифференцировкой опухолей (см. табл. 5, см. рис. 1, и). Наши данные об увеличении доли опухолей с нарушениями локализации и/или снижения экспрессии кавеолина-1 в опухолевых клетках по мере увеличения степени инвазии (критерий Т) согласуются с работой A. Kitowska и соавт. [19].

Мы полагаем, что изменения локализации и/или снижения экспрессии белков Е-кадгерина, кавеолина-1 и β-катенина могут служить комплексными факторами неблагоприятного прогноза при АТК и дополнительными критериями злокачественности при оценке прогноза заболевания после хирургического вмешательства, а также при решении вопроса о необходимости назначения больному адъювантной химиотерапии. Данное предположение требует дальнейшего подтверждения на больших выборках пациентов, а также анализа отдаленных результатов лечения.

Выявление цитоплазматических изоформ актина

В ходе данного исследования провели количественную оценку экспрессии β- и γ-актинов в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками слизистого слоя толстой кишки. По нашим данным, эти две цитоплазматические немышечные изоформы актина могут регулировать злокачественные характеристики неопластических клеток. Смещение баланса в сторону преобладания γ-актинa приводит к усилению свойств ЭМП и ускоренному росту ксенографтов рака толстой кишки in vivo [15].

Мы наблюдали 1,5-кратное увеличение количества γ-актина по сравнению с нормой в 12 из 36 исследованных образцов опухолей, причем на IV стадии заболевания данные изменения зафиксированы в половине образцов (рис. 2, а—в; см. табл. 4), что подтверждает нашу гипотезу о роли γ-актина в формировании злокачественного фенотипа опухолей.

Рис. 2. Флюоресцентное ИГХ-окрашивание на γ-актин: образец нормальной (а) и опухолевой ткани (б). Представлены типичные поля зрения, ×400. Процент случаев увеличения экспрессии γ-актина в зависимости от G (слева) и Т (справа) относительно общего количества образцов для каждой стадии (в). Флюоресцентное ИГХ-окрашивание на β-актин: образец нормальной (г) и опухолевой ткани (д). Представлены типичные поля зрения, ×400. Процент случаев снижения экспрессии β-актина в зависимости от G (слева) и Т (справа) относительно общего количества образцов для каждой стадии (е).

В образцах АТК человека мы выявили снижение количества β-актина в опухолевых клетках по сравнению с нормальным эпителием (в 32 из 36 исследованных образцов опухолей) в среднем на 30% (см. табл. 4, см. рис. 2, г—е). Количество β-актина в опухолевой ткани было снижено по сравнению с нормальным эпителием (р<0,05), более того, уменьшение иммунофлюоресцентного окрашивания коррелировало со снижением дифференцировки опухолей (табл. 7).

Таким образом, методом ИГХ-анализа мы оценили продукцию и локализацию белков цитоскелета β- и γ-актинов, Е-кадгерина, β-катенина и кавеолина-1 в опухолевых клетках образцов АТК по сравнению с нормальными клетками слизистого слоя толстой кишки. По крайней мере, часть исследованных маркеров (Е-кадгерин, β-катенин и β-актин) связана со злокачественными характеристиками опухолей и ассоциирована с ЭМП.

Наименьшее количество молекулярных нарушений на одного пациента выявлено в группе наиболее благоприятного прогноза. Доля опухолей с измененными мембранными белками в целом увеличивается по мере увеличения риска прогрессии, однако точные и статистически достоверные данные по этим маркерам будут получены после увеличения выборки и оценки отдаленных результатов лечения. Изменения Е-кадгерина выявлены в небольшом количестве образцов опухолей, несмотря на то что мутации и полиморфизмы СDH1 оказывают влияние на риск развития новообразований ЖКТ [20].

Вопреки нашим ожиданиям мы не выявили четких корреляций между увеличением количества γ-актина в опухолевых клетках и клиническими характеристиками опухолей. Тем не менее снижение количества β-актина в опухолях подтвердило нашу гипотезу о смещении баланса этих белков по мере проявления признаков злокачественности опухолевых клеток и опухолевой прогрессии.

Наши результаты согласуются с опубликованными данными, полученными на основании экспериментов на других типах опухолевых клеток и тканей. Ранее было показано, что в опухолевых клетках соотношение цитоплазматических изоформ актина нарушается. Значительное уменьшение ИГХ-окраски на β-актин наблюдалось в клетках карцином молочной железы по сравнению с доброкачественными пролифератами [21]. Исключение составляли редкие формы инфильтративного рака молочной железы (так называемые базально-подобные), в которых экспрессия β-актина была снижена только в инвазирующих участках [22].

При ИГХ-исследовании образцов опухолевой ткани шейки матки также выявлено снижение окрашивания на β-актин в структурах рака in situ и инвазивного рака по сравнению с нормальной тканью экзоцервикса и интраэпителиальными неоплазиями [23]. При экзогенном увеличении экспрессии γ-актина клетки становятся более инвазивными и демонстрируют ускоренный рост. Сдвиг баланса в сторону преобладания β-актина в опухолевых клетках имеет обратный эффект, приводящий к нормализации фенотипа, снижению пролиферации и подавлению инвазии. Таким образом, γ-актин можно рассматривать как слабый онкоген, а β-актин — как опухолевый супрессор [15, 24].

Заключение

При ИГХ-анализе парафиновых срезов нормальной и опухолевой тканей, полученных от пациентов с АТК, была подтверждена наибольшая выраженность признаков ЭМП на поздних стадиях опухолевой прогрессии, а именно — снижение экспрессии эпителиального маркера Е-кадгерина и реорганизация β-катенина. Также выявлено изменение соотношения цитоплазматических изоформ актина: гиперэкспрессия γ-актина и снижение экспрессии β-актина, ассоциированные с распространением и дифференцировочным статусом опухоли. Дальнейшее исследование данных маркеров при АТК, а также отслеживание отдаленных результатов лечения позволят подтвердить выявленные в данной работе тенденции.

Своевременная диагностика и выявление изменений в экспрессии различных онкомаркеров на ранних стадиях опухолевой прогрессии значительно облегчают процесс лечения. Выявление корреляции между изменениями экспрессии онкологических маркеров с течением заболевания в первичных и вторичных очагах опухоли поможет детально понять процессы онкогенеза на каждом этапе опухолевой прогрессии, что облегчит разработку более эффективной противоопухолевой терапии.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (соглашение № 14−15−00467).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: П.Б.К., А.В.К., В.А.Р.

Сбор и обработка материала: С.Ю.Б., В.А.Р., М.В.Н., А.В.К.

Статистическая обработка: М.В.Д., В.Б.Д., В.А.Р.

Написание текста: М.В.Н., В.А.Р.

Редактирование: В.К.Л., Н.В.Х., А.В.К., В.Б.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail