Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Кириченко Е.Ю.

НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана Академии биологии и биотехнологии Южного федерального университета

Савченко А.Ф.

нейрохирургическое отделение МБУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», Ростов-на-Дону, Россия

Козаченко Д.В.

нейрохирургическое отделение МБУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», Ростов-на-Дону, Россия

Акименко М.А.

Академия биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского, Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия

Филиппова С.Ю.

Академия биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского, Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия

Мационис А.Э.

ГБУ Ростовской области "Патологоанатомическое бюро", Ростов-на-Дону

Повилайтите П.Э.

Отдел экспериментальной патоморфологии и электронной микроскопии Ростовского областного патологоанатомического бюро, Ростов-на-Дону, Россия

Экспрессия коннексина 43 в глиальных опухолях головного мозга человека

Журнал: Архив патологии. 2017;79(2): 3‑9

Просмотров : 579

Загрузок : 9

Как цитировать

Кириченко Е.Ю., Савченко А.Ф., Козаченко Д.В., Акименко М.А., Филиппова С.Ю., Мационис А.Э., Повилайтите П.Э. Экспрессия коннексина 43 в глиальных опухолях головного мозга человека. Архив патологии. 2017;79(2):3‑9.
Kirichenko EYu, Savchenko AF, Kozachenko DV, Akimenko MA, Filippova SYu, Matsionis AÉ, Povilaitite PE. Connexin 43 expression in human brain glial tumors. Arkhiv Patologii. 2017;79(2):3‑9. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/patol20177923-9

Авторы:

Кириченко Е.Ю.

НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана Академии биологии и биотехнологии Южного федерального университета

Все авторы (7)

Для глиальных опухолей головного мозга человека описан широкий диапазон молекулярных изменений, который включает генетические, эпигенетические, транскриптомные изменения, а также изменения уровня микроРНК [1]. Тем не менее, несмотря на огромное количество данных, полученных за последние 40 лет, феномен нестабильной экспрессии коннексинов остается малоизученным и является своеобразной «визитной карточкой» глиом различной степени малигнизации [2, 3]. В предыдущей работе нами продемонстрирована дифференцированная экспрессия белка щелевых контактов (ЩК) нейронов коннексина 36 в глиомах Grade 2 и Grade 4 (глиобластомах). Показано снижение, но не полное исчезновение экспрессии этого антигена при увеличении степени малигнизации опухоли, что поднимает вопрос об участии цитоплазматического пула коннексина 36 в развитии злокачественного процесса [4]. В то же время известно, что белок ЩК астроглии коннексин 43 (Cx43) играет особую роль в развитии глиом [5]. Выявлено, что для глиальных неоплазм связь между экспрессией Cx43 и биологией опухоли отличается высокой сложностью [1]. Действительно, восстановление уровня экспрессии Сх43 в культуре клеток глиомы снижает скорость клеточной пролиферации и туморогенность. Однако этот онкосупрессивный эффект может быть нивелирован способностью коннексина 43 при определенных условиях усиливать инвазивность, способность к адгезии и миграции клеток опухоли [6]. Механизмы, лежащие в основе этих эффектов, предполагают участие самых разнообразных белков, которые связываются с разными участками молекулы Сх43, а также влияние проводящей функции ЩК и полуканалов.

Закономерности формирования ЩК и экспрессии коннексина 43 в глиальных опухолях в основном изучены на клеточных линиях, и вопрос об их наличии в условиях естественного развития нейроонкопатологии остается открытым. Исследование Щ.К. и полуканалов, образованных коннексином 43 в ткани опухоли, будет способствовать расширению представлений о патогенезе изучаемого злокачественного процесса и послужит основанием для поиска новых терапевтических подходов, нацеленных на восстановление онкосупрессивной активности Сх43 в клетках опухоли и перитуморальной зоны.

Целью настоящей работы являлось иммуногистохимическое (ИГХ) исследование экспрессии коннексина 43 в образцах глиальных опухолей различной степени малигнизации: гемистоцитарных астроцитомах (Grade 2), олигодендроглиомах (Grade 2) и глиобластомах (Grade 4).

Материал и методы

Материалом для исследований служили фрагменты глиальных опухолей головного мозга человека, локализованных преимущественно в лобных долях, резецированные оперативным путем. Опухоли различались по степени злокачественности и включали гемистоцитарные астроцитомы (Grade 2, n=2), олигодендроглиомы (Grade 2, n=2), глиобластомы (Grade 4, n=14), а также фрагменты ткани, окружающей опухоль (n=4). Исследование было одобрено этическим комитетом МБУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи» Ростова-на-Дону. Морфология и иммунофенотип глиальных неоплазм были определены при помощи патоморфологического исследования в сочетании со стандартной диагностической иммуногистохимией (см. таблицу).

Диагностическая иммуногистохимия исследуемых образцов глиом

Материал фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике, 4-микронные срезы изготавливали на автоматическом ротационном микротоме Leica RM 2255 (Германия). После стандартной процедуры депарафинирования, дегидратации проводили тепловую демаскировку антигенов. Тепловую демаскировку антигенов проводили в ретривере Cell Marque (США). Для ИГХ-исследования срезов использовали первичные кроличьи поликлональные антитела к коннексину 43 («Spring Bioscience», США) и систему визуализации Dako EnVision System + Peroxidase (DAB) («Dako», Дания). После проведения ИГХ-реакции ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Полученные срезы изучали под светооптическим микроскопом DM 2500 («Leica», Германия) со встроенной цифровой камерой DFC 495 («Leica», Германия). Положительный контроль реакции с антителами к коннексину 43 проводили на образцах ткани миокарда человека, также осуществляли отрицательный контроль, в котором вместо первичных антител на срезы наносили буфер.

Результаты

В качестве контроля для оценки возможных изменений экспрессии коннексина 43 при опухолевой трансформации исследовано распределение этого белка в ткани мозга, окружающей опухоль. В образцах перитуморальной ткани отмечается равномерная умеренная экспрессия коннексина 43 в нейропиле и более выраженная вокруг сосудов. При большем увеличении визуализируются многочисленные мелкие зерна хромогена, локализованные преимущественно на отростках клеток в нейропиле, а также в области формирования периваскулярных астроцитарных муфт вокруг микрокапилляров (рис. 1).

Рис. 1. Диффузная экспрессия коннексина 43 в образце перитуморальной ткани. Белыми стрелками обозначена реакция вокруг микрокапилляров в периваскулярных муфтах. а* — увеличенный участок нейропиля, демонстрирующий локализацию гранул хромогена (тонкие черные стрелки). МК — микрокапилляр; Н — нейрон; Г — глиоцит. Основное фото — ×400, а* — ×1000.

Исследование образцов опухолей показало, что по сравнению с перитуморальной тканью на препаратах гемистоцитарной астроцитомы, олигодендроглиомы и глиобластомы характер экспрессии коннексина 43 резко меняется. Из равномерной мелкозернистой в нейропиле она трансформируется в основном в крупногранулярную цитоплазматическую (внутриклеточную) и даже ядерную в зависимости от типа исследуемой опухоли. В целом, по нашим наблюдениям, в исследуемых глиомах отмечается снижение экспрессии коннексина 43 в структурах нейропиля, который сам по себе представлен в опухолях в меньшем количестве, т. е. содержание этого белка в отростках клеток обратно пропорционально степени злокачественности опухоли. В образцах гемистоцитарной астроцитомы Grade 2 в опухолевых гемистоцитах, имеющих атипичный вид, экспрессия белка ЩК астроглии в основном крупногранулярная цитоплазматическая и мембранная в отдельных клетках, также визуализируются негативные к коннексину участки ткани. При большом увеличении отмечаются плотные гранулы хромогена различного диаметра в цитоплазме, вокруг ядра и в отдельных тонких сложно переплетенных отростках опухолевых клеток. В некоторых дискретно расположенных опухолевых клетках наблюдается ядерная положительная реакция на исследуемый белок (рис. 2).

Рис. 2. Экспрессия коннексина 43 в образце гемистоцитарной астроцитомы. Белыми стрелками обозначена ядерная локализация антигена в опухолевых клетках. а* — увеличенный участок ткани, демонстрирующий мелкозернистую реакцию в цитоплазме и в отростках опухолевых клеток (тонкие черные стрелки).

ИГХ-исследование олигодендроглиомы Grade 2 выявило выраженную экспрессию коннексина 43 в цитоплазме единичных отдельных крупных клеток опухоли и в их отростках, при этом экспрессия коннексина 43 в ядрах клеток отсутствовала (рис. 3, а). При большом увеличении в единичных участках наблюдаются дискретные мелкие гранулы продукта реакции в нейропиле опухоли, количество которых заметно снижено по сравнению с образцами гемистоцитарной астроцитомы (см. рис. 3, б).

Рис. 3. Экспрессия коннексина 43 в образцах олигодендроглиом Grade 2. а — цитоплазматическая экспрессия коннексина 43 в отдельных крупных опухолевых клетках; б — диффузная цитоплазматическая экспрессия коннексина 43 на уровне единичной опухолевой клетки. Стрелками указана слабовыраженная гранулярная экспрессия в нейропиле опухоли. а — ×400, б — ×1000.

При ИГХ-исследовании глиобластомы Grade 4 очаговая положительная реакция на коннексин 43 выявлена только в 6 из 14 образцов. В положительных на коннексин 43 опухолях отмечается фокальная экспрессия в области так называемых псевдопалисадов — участки с отрицательной реакцией на коннексин сменяются зонами с гранулярной специфической реакцией на исследуемый белок (рис. 4, а). При большом увеличении отмечаются яркие многочисленные крупные и мелкие гранулы хромогена в цитоплазме опухолевых клеток (см. рис. 4, б). Особый интерес представляет отчетливая гранулярная реакция на мембранах отростков опухолевых клеток, возможно, ассоциированная с образованием ЩК или полуканалов. Следует отметить, что, так же как и в образцах гемистоцитарной астроцитомы, в некоторых образцах глиобластом наблюдается ядерная реакция на коннексин 43, что может быть общим признаком астроцитом.

Рис. 4. Экспрессия коннексина 43 в образцах глиобластомы Grade 4. а — экспрессия коннексина 43 в виде микрогранулярной реакции в «псевдопалисадах» глиобластомы; б — увеличенный участок рисунка, демонстрирующий гранулы хромогена в цитоплазме опухолевых клеток (стрелки). а — ×400, б — ×1000.

Обсуждение

Проведенное ИГХ-исследование показало, что по сравнению с неизмененной тканью на препаратах гемистоцитарной астроцитомы, олигодендроглиомы и глиобластомы отмечается изменение распределения и в целом — снижение экспрессии коннексина 43, количество которого обратно пропорционально степени злокачественности опухоли. Эти результаты находят подтверждение в доступной литературе [5—12]. Уменьшение экспрессии коннексина 43 может быть связано как с подавлением транскрипции гена Gja1, кодирующего этот белок, так и со снижением трансляции мРНК и активацией процессов посттрансляционной деградации белка [1]. Процесс угнетения экспрессии коннексина 43 может приводить не только к редукции функциональных астроглиальных ЩК и полуканалов, но и к уменьшению количества самого белка, самостоятельно обладающего анти- и проонкогенными свойствами. К примеру, в ряде работ установлено, что наружные и внутренние домены коннексина 43 способствуют адгезии и усиливают миграцию опухолевых клеток [13—15]. В то же время молекула коннексина 43 обладает противоопухолевой активностью, обусловленной взаимодействием карбоксильных С-концов с веществами, участвующими в регуляции процессов клеточного цикла, пролиферации, дифференцировки и апоптоза [2, 5].

На фоне общего снижения экспрессии белка коннексина 43 отмечены некоторые особенности его распределения в глиальных опухолях по сравнению с образцами перитуморальной ткани мозга. Наиболее отчетливая разница выявлена в уровне экспрессии в цитоплазме опухолевых и неопухолевых клеток и в нейропиле, причем эти отличия наиболее очевидны для ткани олигодендроглиомы и образцов глиобластомы, в меньшей степени выражены в ткани гемистоцитарной астроцитомы. Наблюдаемое фокальное накопление коннексина 43 в цитоплазме клеток опухоли может быть связано с сохраняющейся экспрессией этого белка на фоне активного клеточного деления. Так, во время митоза происходит фосфорилирование С-конца молекулы коннексина 43 по остаткам серина в позициях S255, S262 и S368, которое сопровождается интернализацией белка и его аккумуляцией в цитоплазме. Как правило, после выхода из митотического цикла количество коннексина в цитоплазме уменьшается в результате формирования новых бляшек ЩК на мембране [16]. С другой стороны, наблюдаемое явление аккумуляции белка может быть результатом нарушения формирования коннексонов и накопления промежуточного белка в цитоплазме либо превалирования процесса интернализации. Оба этих процесса в опухолевых клетках могут быть связаны с аберрантной активностью ряда киназ. Так, например, воздействие на клетки некоторых факторов роста через опосредованную активность таких киназ, как протоонкогенная тирозинкиназа Src или протеинкиназа C (PKC), приводит к уменьшению количества коннексонов в бляшках ЩК [1, 17]. При этом ингибирование киназы PKC при опухолевом процессе может приводить к накоплению коннексина 43 в цитоплазме, поскольку ее влияние стимулирует движение белка из цитоплазмы к клеточной мембране [18]. Аберрантная активность протеинкиназы, А (РКА) вполне способна отвечать и за повышенную экспрессию коннексина 43 и в ядрах опухолевых клеток, отмеченную нами в образцах гемистоцитарной астроцитомы и глиобластомы, при отсутствии таковой в образцах неизмененной ткани. Несмотря на то что белок коннексин 43 не имеет участка, отвечающего за транспортировку молекулы в ядро, по немногочисленным имеющимся в литературе данным, этот коннексин, действительно, способен проникать в ядра кардиомиоцитов и HeLa-клеток после их трансформации вектором, экспрессирующим С-конец молекулы коннексина 43 [19]. Транспортировка коннексина 43 в ядро может быть опосредована анкорным белком протеинкиназы, А 95 (АКАР95) при действии РКА во время перехода от G1- к S-фазе [20]. Хотя авторы показали, что Сх43 при этом связывается в ядре с ДНК, на настоящий момент трудно определить роль ядерного пула коннексина 43 в процессах онкогенеза, в том числе для глиальных опухолей головного мозга.

Выявленная при помощи иммуногистохимии диффузная и фокальная экспрессия коннексина 43 в нейропиле глиальных опухолей не всегда может быть ассоциирована с формированием Щ.К. Вероятно, наблюдаемое мелко- и крупногранулярное окрашивание некоторых клеток и их отростков в основном проявляется благодаря наличию полуканалов, содержащих коннексин 43. При этом в литературе обсуждается гипотеза о том, что коннексин 43+ полуканалы способствуют прогрессии астроцитарных опухолей путем обеспечения свободного доступа к внеклеточному АТФ, который является иммуносупрессивным и ростстимулирующим агентом [21].

Заключение

Низкий уровень экспрессии коннексина 43 может отражать как редукцию функциональных астроглиальных ЩК и полуканалов, так и уменьшение количества самого белка, самостоятельно обладающего антионкогенными свойствами. Наблюдаемая цитоплазматическая и ядерная экспрессия коннексина 43, вероятнее всего, связана с аберрантной активностью ряда киназ, таких как протоонкогенная тирозинкиназа Src или протеинкиназа C (PKC).

Работа выполнена при поддержке внутреннего гранта Южного федерального университета № 213.01−07−2014/05 ПЧВГ и гранта РФФИ № 15−04−03035.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.Ю.К., А.Э.М., П.Э.П.

Сбор и обработка материала: А.Ф.С., Д.В.К., М.А.А.

Статистическая обработка данных: Е.Ю.К., П.Э.П., А.Э.М.

Написание текста: Е.Ю.К., С.Ю.Ф.

Редактирование: Е.Ю.К., А.Э.М., П.Э.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail