Русинова Г.Г.

ФГУП Южно-Уральский институт биофизики, Озерск

Вязовская Н.С.

ФГУП Южно-Уральский институт биофизики, Озерск

Азизова Т.В.

ФГУП «Южно-Уральский институт биофизики» Федерального медико-биологического агентства, Озёрск, Челябинская область, Россия

Ревина В.С.

ФГУП Южно-Уральский институт биофизики, Озерск

Глазкова И.В.

ФГУП Южно-Уральский институт биофизики, Озерск

Генерозов Э.В.

ФГАОУ ВО «ПМГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия, ФГБУ «ФНКЦ физико-химической медицины» ФМБА России, Москва, Россия

Захаржевская Н.Б.

Лаборатория молекулярной генетики человека ФГУ НИИ ФХМ Росздрава, Москва

Гурьянов М.Ю.

ФГУП «Южно-Уральский институт биофизики», 456780 Озерск, Челябинская обл, Российская Федерация

Белосохов М.В.

ФГУП «Южно-Уральский институт биофизики», 456780 Озерск, Челябинская обл, Российская Федерация

Осовец С.В.

ФГУП «Южно-Уральский институт биофизики», 456780 Озерск, Челябинская обл, Российская Федерация

Молекулярные механизмы развития рака легкого у работников атомной отрасли

Журнал: Архив патологии. 2015;77(2): 10-15

Просмотров : 52

Загрузок : 2

Как цитировать

Русинова Г. Г., Вязовская Н. С., Азизова Т. В., Ревина В. С., Глазкова И. В., Генерозов Э. В., Захаржевская Н. Б., Гурьянов М. Ю., Белосохов М. В., Осовец С. В. Молекулярные механизмы развития рака легкого у работников атомной отрасли. Архив патологии. 2015;77(2):10-15.
Rusinova G G, Viazovskaia N S, Azizova T V, Revina V S, Glazkova I V, Generozov E V, Zakharzhevskaia N B, Guryanov M Yu, Belosokhov M V, Osovets S V. Molecular mechanisms of lung cancer development at its different stages in nuclear industry workers. Arkhiv Patologii. 2015;77(2):10-15.
https://doi.org/10.17116/patol201577210-15

Авторы:

Русинова Г.Г.

ФГУП Южно-Уральский институт биофизики, Озерск

Все авторы (10)

Эпидемиологическими исследованиями доказано, что радиационное воздействие приводит у человека к повышенному риску развития солидных опухолей и лейкемии [1—4]. Исследования когорты работников предприятия атомной промышленности ПО «Маяк» показали, что у специалистов, подвергшихся внутреннему альфа-облучению от инкорпорированного плутония 239, повышен риск возникновения опухолей легкого, печени и скелета [5, 6].

Патогенетические механизмы развития злокачественных новообразований, в том числе и у лиц, подвергшихся различным видам облучения, исследуют во всем мире [7, 8]. В развитии рака легкого, сложного и многостадийного процесса, большое значение имеют изменения функции генов, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [9, 10]. Из большого количества генов-регуляторов жизни клетки одним из важнейших является опухолевый ген-супрессор , играющий ключевую роль в интеграции сигналов повреждающего воздействия на ДНК с последующей реализацией регуляции прохождения клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза, в связи с чем он назван «стражем генома» [11]. Изменение функционирования гена приводит к нарушению контроля повреждений ДНК и к осуществлению апоптоза, что в свою очередь вызывает нестабильность генома и может играть определенную роль в развитии рака. Ген является наиболее часто мутирующим геном при злокачественных новообразованиях. Более того, считается, что в каждом случае рака наблюдается уменьшение активности гена [12].

Учитывая стадийность развития рака, пока недостаточно ясно, на какой стадии выявляется нарушение функционирования гена .

По данным литературы, 90% мутаций, выявляемых в злокачественных новообразованиях у человека, возникают в центральном ДНК-связывающем домене гена , включающем 5—8-й экзоны. Этот домен играет исключительно важную роль в проявлении транскрипционной активности гена [13].

Целью настоящего исследования являлась оценка мутационных событий в 5, 7 и 8-м экзонах гена и выявление мутантного белка р53 в морфологически верифицированных случаях измененной (пролиферативные и предопухолевые изменения, рак легкого), а также гистологически неизмененной ткани легкого работников, подвергшихся профессиональному облучению.

Для исследования были использованы фиксированные в формалине залитые в парафиновые блоки (ФФПБ) ткани легкого из радиобиологического репозитория тканей человека (РРТЧ) Южно-Уральского института биофизики [14]. Были исследованы пролиферативные изменения (гиперплазии) — 4 случая, предопухолевые изменения (дисплазии) — 5 и рак легкого — 5 случаев (3 случая аденокарциномы и 2 — мелкоклеточного рака). В качестве контроля использовали участки неизмененной ткани легкого у этих же больных. Срезы ткани толщиной 5 мкм, подготовленные из парафиновых блоков, окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике [15]. После морфологической верификации случаев из соответствующих блоков вновь изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Для элиминации маскировки антигенных детерминант, развившейся вследствие фиксации ткани в формалине, проводили демаскировку по HEAT-методу [16].

Иммуногистохимическое исследование по определению мутантного белка р53 проводили, основываясь на особенности мутантного конформационно-измененного белка р53 накапливаться в ядрах клеток, что дает возможность его определения иммуногистохимическими методами, в отличие от неизмененного белка р53, обладающего коротким полупериодом жизни.

Определение мутантного белка р53 проводили с применением непрямого иммунопероксидазного метода [17]. В работе использовали первичные мышиные антитела к протеину p53 («DAKO», Дания). Для детекции результатов применяли NovoLink Polymer Detection System (LEICA microsystems) с ДАБ (диаминобензидин)-хромогеном. После инкубации с ДАБ срезы докрашивали гематоксилином, входящим в набор реактивов для визуализации ядер. Интенсивность иммуногистохимической реакции оценивали на микроскопе Olympus BX40. Изображения оцифровывали в программе MMCam с использованием цифровой фотокамеры MicroCam 5 М. Далее подсчитывали общее количество клеток в фокусах измененной ткани легкого и количество клеток с выпавшим в зоне ядра ДАБ, дающим коричневое окрашивание, что свидетельствовало о наличии мутантного белка р53, с последующим расчетом доли р53-позитивных клеток. Для проведения молекулярно-генетических исследований выделяли препараты ДНК из ФФПБ ткани легкого с использованием 5 срезов толщиной 10 мкм, согласно протоколу производителя набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit фирмы «QIAGEN» [18]. Количественный и качественный анализ выделенной ДНК, проведенный методом спектрофотометрии и электрофореза, показал их удовлетворительное качество. С целью изучения мутационного процесса гена исследовали 5, 7 и 8-й экзоны, обладающие повышенной частотой мутаций при развитии рака различной локализации. При этом экзон 5 был «разбит» на два участка (5A и 5B), каждый из которых анализировали отдельно. Для получения достаточного для анализа количества специфических фрагментов гена использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимый по следующей схеме: к 100 нг матрицы ДНК добавляли по 6 пмоль каждого праймера, 6 мкмоль каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP), смесь ферментов TrueStart Hot Start полимеразы (Fermentas) в количестве 0,48 ед. и рекомбинантной Pfu-полимеразы (Fermentas) в количестве 0,12 ед. (соотношение 4:1), 90 нмоль MgCl. Для исследования использовали следующие нуклеотидные последовательности: экзон 5А, праймеры F: ctctgtctccttcctctt, R: GC-tgtgactgcttgtagatg, длина исследуемого фрагмента 190 п.н.; экзон 5 В, праймеры F: GC-ttccacacccccgcccg, R: gccctgtcgtctctcca, длина исследуемого фрагмента 191 п.н.; экзон 7, праймеры F: GC-gcctgtgttatctccta, R: cagggtggcaagtggct, длина исследуемого фрагента 191 п.н.; экзон 8, праймеры F: cctcttgcttctcttttc, R: GC-ccaccgcttcttgtcctg, длина исследуемого фрагмента 235 п.н. Температура отжига для фрагментов экзона 5А и 5 В соответствовала 55 °C, для экзона 7 — 58 °C, для экзона 8 — 56 °C. Детекцию продуктов реакции ПЦР проводили с помощью метода TTGE (гель-электрофореза продуктов реакции ПЦР при временнóм градиенте температуры), позволяющего обнаружить наличие/отсутствие мутаций [19]. Для подтверждения найденных методом TTGE мутаций и определения их вида и места локализации использовали модифицированный метод секвенирования по Сэнджеру [20]. Анализ полученных фрагментов ДНК осуществляли на 16-капиллярном секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США; «Hitachi», Япония) с использованием наборов (BigDye Terminator v1.1) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями, представленными в базе данных GeneBank .

В качестве базового программного пакета для интерпретации данных секвенирования использовали программу SeqScape («Applied Biosystems», США) и программные модули KB Basecaller («Applied Biosystems», США). Для статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica 6.0. Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия Стьюдента (при ≤0,05).

В табл. 1 приведены характеристики доноров, бывших работников ПО «Маяк», привлеченных к исследованию, с верифицированными пролиферативными (1-я группа) и предопухолевыми (2-я группа) изменениями ткани легкого и раком легкого (3-я группа) [21]. Не установлено статистически значимых различий между группами по полу и возрасту на момент смерти. Выявлено, что в группе рака легкого средняя поглощенная доза внутреннего альфа-облучения от инкорпорированного плутония-239 в легких была наибольшей по сравнению с другими группами. В этой же группе индекс курения статистически значимо отличался от показателей в других группах (см. табл. 1).

Иммуногистохимический анализ показал отсутствие мутантного белка р53 в клетках неизмененной ткани легкого и увеличение количества клеток с мутантным белком р53 у всех больных при пролиферативных и предопухолевых изменениях, и при раке легкого (табл. 2). Результаты подсчета клеток показали широкую вариабельность экспрессии мутантного белка р53 в клетках с пролиферативными изменениями (бокаловидно-клеточная гиперплазия) — доля р53-позитивных клеток варьировала от 13,2 до 59,1%, а средняя величина составила 34,85±11,94 (см. табл. 2 и рис. 1). Примерно такая же вариабельность экспрессии мутантного белка р53 выявлена в очагах дисплазии эпителия — в клетках с предопухолевыми изменениями (см. табл. 2 и рис. 1).

В клетках рака легкого доля р53-позитивных клеток варьировала от 20,7 до 90,2%, а средняя величина составила 44,74±12,18 (см. табл. 2). При этом количество клеток с мутантным белком p53 было неодинаково в опухолях различной гистоструктуры. Так, количество клеток с мутантным белком p53 было меньшим в аденокарциноме, в то время как синтез мутантного белка p53 был выявлен в большем числе клеток мелкоклеточного рака (см. рис. 1). Однако в целом различия между долями р53-позитивных клеток в ткани легкого с пролиферативными и предопухолевыми изменениями и в ткани рака легкого были статистически незначимы, по-видимому, из-за малого числа наблюдений (см. табл. 2).

Таким образом, иммуноморфологическое исследование показало, что во всех случаях измененной ткани легкого выявлены клетки с мутантным протеином р53. Метод иммуноморфологического исследования с использованием моноклональных антител позволил зарегистрировать экспрессию мутантного белка p53 и судить об утрате свойств контроля клеточных функций геном в клетках с мутантным протеином р53. Применение молекулярно-генетического анализа дало возможность определить месторасположение и тип мутаций в гене .

Для молекулярно-генетического анализа была выделена ДНК из ФФПБ архивной ткани легкого. Количественный выход ДНК, полученной из разных ФФПБ ткани легкого, существенно варьировал в пределах 9,30—549,50 нг/мкл, что связано с историей получения, фиксации и хранения данного блока. Первый этап по обнаружению мутаций в 5, 7 и 8-м экзонах гена в подобранных случаях проводили с использованием TTGE-анализа (гель-электрофорез продуктов реакции ПЦР при временнóм градиенте температуры). При TTGE-анализе 5, 7 и 8-го экзонов было обнаружено 6 мутаций, о чем свидетельствовало наличие 2 и более различных по нуклеотидной последовательности продуктов (табл. 3).

Для подтверждения результатов, полученных TTGE-методом, было проведено секвенирование 5, 7 и 8-го экзонов, при этом одна предполагаемая мутация (5-й экзон, образец № 7), обнаруженная TTGE-методом, при секвенировании не подтвердилась. Это, по-видимому, связано с тем, что при TTGE-анализе появление разных по нуклеотидной последовательности продуктов может возникать не только при наличии мутации, но и вследствие ошибок полимеразы, при недостатке или избытке праймеров, избытке матрицы ДНК, а также из-за ее индивидуальной характеристики. Кроме того, обнаружена новая мутация в случае № 39, которая не была выявлена при исследовании методом TTGE-анализа (см. табл. 3 и рис. 2).

Был также обнаружен TTGE-методом и подтвержден при секвенировании редкий случай расположенных рядом мутаций в 5-м экзоне пробы № 4106 — 226 Met/Ile (677 G/T) и 227 Ala/Ser (678 G/T) (см. табл. 3).

Общее количество мутаций гена в 5, 7 и 8-м экзонах, обнаруженных TTGE-методом и подтвержденных секвенированием, равно 6 (см. табл. 3). Все выявленные мутации были трансверсиями (замена пурина на пиримидин, или наоборот), что указывает на воздействие экзогенных мутагенов [22]. При этом наблюдалось увеличение количества мутаций в группе рака легкого по сравнению с другими группами. Так, по 1 мутации было найдено в группах пролиферативных и предопухолевых изменений и 4 мутации в группе рака легкого. При этом можно выделить случай № 4106 с несколькими мутациями в 5-м и 7-м экзонах (см. табл. 3). Общее число случаев в группах с пролиферативными и предопухолевыми изменениями ткани легкого и группе рака легкого, в которых были обнаружены мутации гена , составило 25, 20 и 40% соответственно.

Сопоставляя результаты TTGE-анализа и секвенирования с данными иммуногистохимического исследования тех же образцов, можно отметить, что клетки с мутантным белком p53 были выявлены во всех случаях измененной ткани легкого, а мутации были обнаружены далеко не во всех исследованных образцах измененной ткани легкого. Эти результаты хорошо согласуются с данными литературы. Так, для некоторых раков, например в случае колоректального рака, наблюдалась сильная корреляция накопления мутантного белка р53 и мутаций в гене [23], в то время как при раке легкого сильной связи не обнаружено [24].

В настоящей работе были исследованы 3 из 11 экзонов гена  — это 5, 7, 8-й экзоны центрального домена гена, в которых выявляют 90% всех возникающих мутаций в злокачественных новообразованиях у человека. Кажется очевидным, что остальные 10% мутаций, возникающих в других экзонах гена , из-за малой вероятности их возникновения, не окажут какого-либо существенного влияния на появление мутантного протеина р53 в измененной ткани легкого. Можно предполагать, что существуют другие причины, кроме мутационных изменений гена , приводящие к появлению мутантного белка р53. Это могут быть сплайсинговые мутации или посттранскрипционные нарушения активности мРНК с участием микроРНК [13]. В то же время результаты настоящего исследования подтверждают данные других исследователей о том, что мутации гена при раке легкого наблюдаются в 40—70% случаев [25].

Выявление мутаций гена в 25% случаев пролиферативных, 20% — предопухолевых изменений ткани легкого и в 40% — рака легкого по сравнению с присутствием аномального белка р53 в 100% случаев измененной ткани легкого отражает сложные многоуровневые взаимодействия, определяющие функционирование гена в клетке. Эти взаимодействия затрагивают начальные структурные изменения гена (мутации) и могут включать посттранскрипционные модификации экспрессии гена и эффекты, связанные с конформационными изменениями белка р53.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.В.А., Г.Г. Р., М.В.Б.

Сбор и обработка материала: Н.С.В., М.В.Б., В.С.Р., И.В.Г. , М.Ю.Г. , Э.В.Г. , Н.В.З.

Статистическая обработка данных: С.В.О.

Написание текста: Г.Г. Р.

Редактирование: Г.Г. Р.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail