В настоящее время для исследования биологического материала, фиксированного в формалине, сохраненного в виде парафиновых блоков (ФФПБ), используют молекулярно-генетические методы, обеспечивающие возможность анализа изменений на уровне генома [1-3], успешность применения которых напрямую зависит от количества и качества выделенной геномной ДНК.
Целью исследования являлись подбор оптимальных условий выделения ДНК из ФФПБ ткани легкого и оценка возможности ее использования в молекулярно-генетических исследованиях.
Исследование проведено на биологических образцах тканей легкого, полученных при аутопсии и хранящихся в Радиобиологическом репозитории тканей человека [4]. Было отобрано 32 ФФПБ фрагментов ткани легкого, подготовленных в 1981-2007 гг. [5]. Выделение ДНК из свежеприготовленных срезов проводили с помощью набора для выделения ДНК из ФФПБ (QIAGEN, США). Количественный анализ препаратов ДНК осуществляли с помощью спектрофотометра («Spectronic Genesys 5», США). Степень фрагментации ДНК оценивали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, определяя длину фрагментов выделенной ДНК с помощью маркера pUC19/MspI («СибЭнзим»). Полногеномную амплификацию проводили с использованием специального набора (QIAGEN, США). Для проверки способности выделенной из ткани ФФПБ ДНК к ПЦР проведено определение полиморфных вариантов гена-супрессора опухоли р53 (Arg/Pro, rs:104252), что являлось задачей дальнейших исследований. Для проведения генотипирования использовали метод ПЦР-ПДРФ анализа [6], соблюдая следующие условия: при температуре отжига 61 °С использовали олигонуклеотидные праймеры (ООО «Синтол») - F: TTG-CCG-TCC-CAA-GCA-ATG-GAT-GA; R: TCT-GGG-AAG-GGA-CAG-AAG-ATG-AC; для проведения ПДРФ-анализа использовали фермент рестрикции BstFNI («СибЭнзим»). Помимо метода ПЦР-ПДРФ, генотипирование осуществляли MALDI-TOF масс-спектрометрией, анализируя продукты реакции минисеквенирования с помощью MALDI-времяпролетного масс-спектрометра Microflex («Bruker Daltonics», Германия). Масс-спектры интерпретировали с помощью программного обеспечения flexControl 2.4 и flexAnalysis 2.4. Для статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica 6.0.
Проведен подбор условий для оптимизации выделения ДНК (с использованием срезов одного блока), включающий такие факторы, как количество протеиназы К, время инкубации с протеиназой К и количество срезов. Был выбран оптимальный комплекс условий: 5 срезов ткани легкого ФФПБ толщиной 10 мкм, 20 мкл протеиназы К и время инкубации с протеиназой К 4 ч.
Из 32 образцов ДНК 78% было успешно генотипировано как при помощи ПЦР с последующим ПДРФ-анализом, так и методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. С помощью электрофореза было установлено, что в пробах, где генотипирование прошло успешно, длина фрагментов ДНК была более 500 п.н., а в оставшихся 22% проб длина фрагментов ДНК была менее 500 п.н., что скорее всего и явилось причиной невозможности проведения ПЦР [1, 7]. Проведение полногеномной амплификации в 22% образцов для улучшения качественных и количественных характеристик деградированной ДНК позволило успешно провести генотипирование в этих пробах с использованием метода MALDI-TOF масс-спектрометрии и не было результативным при применении метода ПЦР-ПДРФ.
Использование в молекулярно-генетических исследованиях ДНК, выделенной из ФФПБ со сроком хранения более и менее 10 лет, было успешным в 66,7 и 100% случаев соответственно. Следует отметить, что 22% проб ДНК, имеющих недостаточное качество для проведения метода ПЦР-ПДРФ, было получено из ткани ФФПБ со сроком хранения более 10 лет.
Таким образом, можно предположить, что качество ДНК, выделенной из ткани ФФПБ, не зависит от срока хранения самих ФФПБ при условии правильного их изготовления и хранения, а зависит от условий сохранения тел умерших, технологии фиксации и хранения ткани, взятой при аутопсии, где в этом направлении в последние годы в РФ произошел качественный сдвиг в положительную сторону [1, 5, 8].