Ершов В.А.

СПб ГУЗ "Городской клинический онкологический диспансер"

Чирский В.С.

ФВГБОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова», Санкт-Петербург

Вязовая А.А.

ФГУН "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" Роспотребнадзора

Нарвская О.В.

ФГУН "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" Роспотребнадзора

Лисянская А.С.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова

Активность процессов пролиферации и апоптоза при интеграции ДНК вируса папилломы человека 16-го типа в цервикальный эпителий

Журнал: Архив патологии. 2013;75(2): 16‑19

Просмотров : 141

Загрузок : 1

Как цитировать

Ершов В.А., Чирский В.С., Вязовая А.А., Нарвская О.В., Лисянская А.С. Активность процессов пролиферации и апоптоза при интеграции ДНК вируса папилломы человека 16-го типа в цервикальный эпителий. Архив патологии. 2013;75(2):16‑19.
Ershov VA, Chirsky VS, Viazovaia AA, Narvskaia OV, Lisianskaia AS. Activity of proliferative and apoptotic processes in the integration of human papillomavirus type 16 DNA into the cervical epithelium. Arkhiv Patologii. 2013;75(2):16‑19. (In Russ.).

Авторы:

Ершов В.А.

СПб ГУЗ "Городской клинический онкологический диспансер"

Все авторы (5)

Запуск механизма интегрирования вируса папилломы человека (ВПЧ) возможен при вступлении клетки в фазу митоза [1], что наблюдается в ходе регенерации поврежденного участка эпителия шейки матки при проникновении вируса в пролиферирующие базальные клетки многослойного плоского эпителия (МПЭ) и резервные клетки в ходе их плоскоклеточной метаплазии непрямого генеза [2]. Процесс интеграции вирусной ДНК в ДНК клетки сопровождается потерей функциональной активности вирусного белка Е2, приводящей к повышению синтеза вирусных белков Е6 и Е7 [3—5], повреждающих, соответственно, ген р53 и ген рRb и исключающих активность опухолевых супрессоров эпителия в фазе G1 [6], что может привести к неконтролируемой клеточной пролиферации.

Целью исследования являлась оценка активности пролиферации и апоптоза цервикального эпителия при различной степени интеграции ВПЧ в ДНК клетки.

Проведен анализ результатов цитологического, иммуноцитохимического, гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического методов исследования эпителия шейки матки 60 ВПЧ-инфицированных женщин от 22 лет до 61 года, находившихся на лечении по поводу цервикальной интраэпителиальной неоплазии в Санкт-Петербургском городском клиническом онкологическом диспансере с октября 2010 г. по май 2011 г.

Цитологические препараты соскобов эктоцервикса и эндоцервикса готовили методом жидкостной цитологии и окрашивали по методу Папаниколау.

Для гистологического исследования использовали материал, полученный при электроэксцизии шейки матки, который фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали в этиловых спиртах восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки. С помощью микротома готовили срезы толщиной 5—6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.

В 20 случаях проводили иммуноцитохимические, в 40 — иммуногистохимические исследования с использованием системы детекции «Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & Dab Plus Chromogen» (TL-015-HD) и моноклональных кроличьих антител к Ki-67 (SP6, RM-9106-SO), к p53 (SP5, RM-9105-SO) производства фирмы «Thermo Scientific для Lab Vision Corporation» (США).

Полученные результаты иммуноморфологических исследований, подсчета митозов и многоядерных клеток оценивали при эктопии и интраэпителиальной неоплазии среди клеток всех слоев МПЭ и метаплазированных резервных клеток, при инфильтративном раке — среди опухолевых клеток.

Заключения результатов цитологических исследований формулировали в соответствии с классификацией The Bethesda System for reporting cervical cytologic diagnoses [7], гистологических исследований — в соответствии с последней редакцией гистологической классификации Всемирной организации здравоохранения [8].

Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ в соскобе цервикального канала проводили методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе Rotor Gene («Corbett Research», Австралия) с использованием комплектов реагентов ФГУН ЦНИИЭ.

Физический статус ДНК (эписомная и интегрированная формы) ВПЧ 16-го типа (ВПЧ-16) оценивали по соотношению количества вирусных генов Е2/Е7 с учетом стандартного отклонения и коэффициента вариации [9—11].

Расчет степени интеграции ДНК ВПЧ-16 осуществляли по формуле:

(1 – Е2/Е7)×100%,

где Е2 — число копий гена Е2, Е7 — число копий гена Е7.

Степень интеграции ДНК ВПЧ-16 определяли как низкую (1—33%), умеренную (34—66%), выраженную (67—99%) или полную (100%).

Достоверность различий полученных результатов оценивали на основании критерия Фишера с уровнем значимости p<0,05.

В результате морфологического исследования операционного материала у 3 (5%) женщин диагностирована эктопия шейки матки, у 3 (5%) — слабая (CIN1, LSIL), у 12 (20%) — умеренная (CIN2, HSIL), у 26 (43,4%) — тяжелая форма дисплазии (CIN3, HSIL). Интраэпителиальный рак (CIN3, HSIL, Carcinoma in situ — Ca in situ) и плоскоклеточный рак шейки матки (SCC) верифицированы каждый в 8 (13,3%) случаях.

ВПЧ-16 обнаружен в 42 (70%) случаях, его сочетания с папилломавирусами филогенетической группы (ФГГ) α9 — в 15 (25%), с ФГГ α7 — в 3 (5%) случаях.

По результатам ПЦР эписомная форма вирусной ДНК выявлена у 9 (15%) пациенток. Низкая степень интеграции обнаружена в 33 (55%) случаях, умеренная — в 10 (16,7%), выраженная — в 3 (5%), полная — в 5 (8,3%; таблица).

В отличие от результатов, полученных другими авторами [12], в препаратах эктопии и CIN1 клеток с экспрессией Ki-67 нами не обнаружено. При CIN2 (см. рисунок, а)

Рисунок 1. Критерии пролиферации и апоптоза в цервикальном эпителии. а — экспрессия Ki-67 в парабазальных клетках в цитологическом препарате CIN2. Иммунопероксидазное окрашивание. ×400; б — экспрессия Ki-67 в опухолевых клетках в гистологическом препарате SCC. Иммунопероксидазное окрашивание. ×400; в — митоз (метафаза) плоского эпителия эктоцервикса в гистологическом препарате CIN3. Иммунопероксидазное окрашивание. ×600; г — митоз (анафаза) плоского эпителия эктоцервикса в цитологическом препарате CIN3. Окраска Папаниколау. ×800; д — к-митоз в цитологическом препарате SCC. Окраска Папаниколау. ×600; е — двуядерная клетка промежуточного слоя МПЭ в цитологическом препарате CIN1. Окраска Папаниколау. ×600; ж — 2—5-ядерные атипичные клетки типа парабазальных в цитологическом препарате Ca in situ. Окраска Папаниколау. ×600; з — экспрессия р53 в многоядерной клетке (вверху) в гистологическом препарате CIN3. Иммунопероксидазное окрашивание. ×400.
и Ca in situ их количество снижалось в первом случае с 8,9±0,3% при низкой интеграции до 3,5±0,2% при умеренной и до 0% при полной интеграции, во втором — с 8,8±0,3% при эписомной форме до 3,1±0,2% при умеренной интеграции. При тяжелой дисплазии и SCC (см. рисунок, б) отмечено увеличение численности клеток с экспрессией Ki-67 в первом случае с 3,3±0,2% при эписомной форме до 20,8±0,4% при полной интеграции, во втором — с 0% при эписомной до 5,3±0,2% при полной интеграции соответственно. Достоверной корреляции значений экспрессии Ki-67 со степенями CIN, представленной в литературе [13, 14], в наших исследованиях не выявлено.

Метафазу (см. рисунок, в), телофазу и анафазу (см. рисунок, г) наблюдали в препаратах тяжелой дисплазии при низкой интеграции в 2,6±0,2% атипичных клеток, умеренной — в 1,3±0,1%, полной — в 2,5±0,2%. В случае Ca in situ митозы выявлены при эписомной форме в 2,6±0,2% опухолевых клеток, при низкой степени интеграции — в 3,4±0,2%, при умеренной — в 2,9±0,2%. В случаях SCC митозы обнаружены в 8,2±0,3% клеток рака при низкой и в 7,3±0,3% — при выраженной степени интеграции.

Патологические митозы, представленные к-митозами (см. рисунок, д), наблюдали при SCC в 2,7±0,2% опухолевых клеток при низкой и в 2,8±0,2% — при выраженной формах интеграции ДНК ВПЧ, что составило соответственно 30,6±0,5 и 27,9±0,4% от общего числа всех митозов и было выше данных литературы [15].

Двуядерные койлоциты (см. рисунок, е) — производные нарушения цитотомии, обнаружены во всех наблюдениях эктопии, CIN1, CIN2, в 90,9% случаев тяжелой дисплазии, в 87,5% — Ca in situ, в 66,7% — SCC, соответственно. В 55,9% исследований CIN3 их дополняли трехядерные и более (до 12 ядер) койлоциты. Многоядерные клетки парабазального слоя в препаратах эктопии и CIN1 не выявлены. Их наблюдали в 58,3% случаев CIN2, в 73,1% случаев тяжелой дисплазии, в 62,5% случаев Ca in situ(см. рисунок, ж) и в 87,5% случаев SCC. Численность многоядерных клеток парабазального слоя увеличивалась при эписомной форме ДНК ВПЧ с 16,7±0,4% в препаратах тяжелой дисплазии до 18,9±0,4% при SCC, при низкой интеграции — с 4,4±0,2% при CIN2 до 10,6±0,3% при SCC. В случаях умеренной, выраженной и полной степени интеграции при CIN2 и CIN3 они не обнаружены, а в случаях выраженной и полной интеграции при SCC их количество не превышало 1,2±0,1%.

Экспрессия р53 в 88,9% исследований эписомной формы отсутствовала. Ее выявили только в одном случае SCC в 0,01% опухолевых клеток, что подтверждает опубликованные ранее данные [16]. При низкой интеграции ДНК ВПЧ р53 выявлен в половине случаев CIN1 в 1,5±0,1% атипичных клеток, в 20% случаев CIN2 — в 1,5±0,1% клеток, в 7,1% случаев тяжелой дисплазии — в 0,1±0,03% клеток (см. рисунок, з), в половине наблюдений Ca in situ в 0,6±0,1% опухолевых клеток и в 20% случаев SCC — в 1,1±0,01% клеток рака. При умеренной, выраженной и полной интеграции ДНК ВПЧ экспрессию р53 не наблюдали.

Совместная экспрессия Ki-67 и p53 отмечена при низкой интеграции в 8,3% случаев CIN2, в 7,7% случаях тяжелой дисплазии, в 25% случаях Ca in situ и в 37,5% случаях SCC. Численность клеток с экспрессией Ki-67 превышала численность клеток с p53 при CIN2 в 4,5 раза, при тяжелой дисплазии — в 17,5 раза, при Ca in situ — в 7 раз, при SCC — в 3,4 раза.

Заключение

В результате анализа результатов проведенных исследований установлено, что частота выявления маркеров пролиферации не связана с выраженностью интеграции ДНК ВПЧ-16. Количество клеток с экспрессией Ki-67, с митозами и с их нарушениями напрямую связано со степенью изменений цервикального эпителия. Экспрессия р53 отмечена лишь при эписомной форме и низкой степени интеграции ДНК ВПЧ-16.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail