Канцерогенез и прогрессия эпителиальных опухолей обусловлены не только свойствами злокачественных эпителиальных клеток, но и опухолевой стромой вокруг опухолевых стволовых клеток, которая выполняет регуляторную, питательную и «каркасную» функции и представлена мезенхимальными клетками разного типа, а именно иммунными, эндотелиальными, перицитами, опухоль-ассоциированными фибробластами (CAF) и продуцируемым ими экстрацеллюлярным матриксом [1].

В строме большинства органов расположены фибробласты — покоящиеся веретеновидные клетки (в фазе G0), обладающие низкой метаболической и транскрипционной активностью, αSMA-негативные и экспрессирующие классические мезенхимные маркеры, такие как виментин, интегрин-α1β1 и FSP-1 [2, 3]. Такие фибробласты способны к активации, например, во время заживления ран, острого и хронического воспаления и фиброза. Фибробласты расположены в большинстве органов, в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки и желудка. Активированные фибробласты имеют звездчатую форму, экспрессируют αSMA, гладкомышечный миозин, виментин, десмин-отрицательны, продуцируют многие компоненты внеклеточного матрикса, такие как коллагены, ламинины и фибронектины, и поэтому определяются как миофибробласты — мезенхимальные клетки, несущие маркеры фибробластов и гладкомышечных клеток (рис. 1, а,

Опухоль-ассоциированные фибробласты (cancer-associated fibroblasts, CAF) — общее название гетерогенной группы неэпителиальных неиммунных клеток с мезенхимными свойствами, расположенными в строме опухоли или по ее краю [3]. Фибробласты, ассоциированные с опухолью, имеют активированный фенотип и в зависимости от их происхождения, морфологии и распределения именуются миофибробластами, активированными опухолевыми фибробластами или (чаще) опухольассоциированными фибробластами (CAF) [3]. В сравнении с нормальными активированными фибробластами CAF характеризуются большей пролиферативной активностью, миграционной способностью, повышенным синтезом факторов роста и хемокинов. Активированные фибробласты продуцируют белки MMP, разрушающие внеклеточный матрикс, способствующие повышению подвижности и инвазии опухолевых клеток. Также MMP расщепляют E-кадгерин, обеспечивая эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) [5]. CAF описаны для большого количества опухолей [3]. По современным представлениям, опухоли можно рассматривать как раны, которые не заживают, поскольку постоянное появление и накопление опухолевых клеток в ткани представляет собой продолжающееся повреждение ткани, инициирующее хроническую реакцию заживления ран по отношению к опухолевым клеткам. Хотя роль миофибробластов в заживлении ран хорошо понятна, их функциональная роль в прогрессировании рака и метастазировании более сложная: с одной стороны, они рассматриваются как факторы прогрессии опухоли, с другой — как факторы, сдерживающие ее развитие [2].

Происхождение CAF обсуждается, однако больше данных, подтверждающих их дифференцировку из покоящихся фибробластов под действием стресса, гипоксии, факторов роста и цитокинов, секретируемых опухолевыми (эпителиальными) клетками и вызываемых десмопластическую реакцию стромы — ключевую характеристику большинства солидных опухолей и их метастазов. Принципы активации фибробластов до конца не изучены, однако предполагаются два механизма: обратимый (из покоящегося фибробласта в миофибробласт) и необратимый (из миофибробласта в CAF) [2]. Важная роль в активации отводится также повышенной продукции внеклеточного матрикса, реорганизации цитоскелета, что приводит к приобретению фибробластами сократительной способности (см. табл. 1). Приобретенные синтетические функции ассоциированы с секреторной и миграционной функциями, которые увеличивают активацию, привлечение и пролиферацию фибробластов. Обратимость процесса возможна с помощью репрограммируемого апоптоза активированных фибробластов после завершения процесса заживления [2]. По альтернативным версиям CAF происходят из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток, эпителиальных клеток (через ЭМП) и эндотелиальных клеток (посредством эндотелиально-мезенхимального перехода) [6].

Множество факторов, секретируемых CAF, поддерживает пролиферативный потенциал опухолевых эпителиальных клеток колоректального рака, обеспечивает их «бессмертность» и подавляет влияние супрессоров [3]. CAF колоректального рака секретируют эпидермальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов, сосудистый и тромбоцитарный фактор роста, что приводит к активации киназ MAPK, PI3K, безудержному клеточному росту, перестройке цитоскелета, инвазии, индукции ангиогенеза, избеганию иммунного ответа и регионарному и отдаленному метастазированию. Подтверждает роль CAF в канцерогенезе тот факт, что опухолевые клетки, резистентные к химиотерапии in vivo, становятся чувствительными к ней in vitro, что обусловлено барьерными функциями опухолевого матрикса [6]. Также CAF секретируют лактат и пируват в качестве энергетических метаболитов гликолиза, которые используются в митохондриальном цикле опухолевых клеток. Этот феномен носит название «обратный эффект Варбурга» [7]. Суммируя CAF, модулируют прогрессирование опухоли и терапевтический ответ с помощью многочисленных молекулярных механизмов, включающих: 1) прямое воздействие на эпителиальные клетки через растворимые факторы и экзосомы; 2) косвенное воздействие через другие стромальные клетки и 3) косвенное воздействие через синтез и ремоделирование внеклеточного матрикса [8].

Проведенное M. Bardiel-Acer и соавт. [9] исследование показало, что в условиях культивирования растворимые факторы, секретируемые CAFs, увеличивали клоногенность и миграцию линий эпителиальных опухолевых клеток в большей степени, чем нормальные фибробласты толстой кишки (NCF) от того же пациента с колоректальным раком. CAF in vivo были более компетентными в качестве усилителей роста опухоли, чем парные NCF после соединения с колоректальными клеточными линиями. Генетический анализ выявил 108 генов, экспрессия которых отличалась между CAF и NCF (у 38 увеличена и у 70 уменьшена), большинство из которых являлось фибробластспецифичными. Анализ представленных групп генов (GSEA) выявил различный транскрипционный профиль CAF, преимущественно участвующих в Wnt-сигнальном пути, клеточной адгезии и клеточном цикле. Как дерегулированные гены, так и вовлеченные биологические процессы показали значительную степень сходства с дерегулированными генами в CAFs молочной железы, легких, пищевода и простаты [10—12]. Эти наблюдения предполагают, что подобные транскриптомные программы могут быть активными при переходе от нормального фибробласта в прилежащих к опухоли тканях к CAFs независимо от их органной принадлежности [9].

Однако роль CAF в канцерогенезе до конца не раскрыта, не все авторы единогласно признают их роль в прогрессии опухоли. Есть мнение, что активация фибробластов является защитной реакцией организма, направленной на сдерживание и подавление опухолевого роста [8, 13]. Большое количество споров вызывает роль «реактивного» опухолевого фиброза в прогрессии карциномы in situ [14]. Дополнительные исследования требуются для выявления активированных фибробластов в доброкачественных опухолях, например определение принадлежности αSMA-положительных клеток в доброкачественных образованиях толстой кишки (см. рис. 1, б): сохранные перикриптальные фибробласты или активированные фибробласты, предшественники CAF. Роль этих миофибробластов остается неясной. Таким образом, влияние CAF на опухолевые клетки велико, эти взаимодействия требуют отражения в практической диагностической работе и побуждают к поиску новых таргетных препаратов.

Для идентификации CAF используются такие маркеры, как гладкомышечный актин альфа (αSMA), белок активации фибробластов (FAP), фибробласт-специфический белок (FSP-1), десмин, подопланин, нейроглиальный антиген-2 (NG2) и рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-α и PDGFR-β) [15]. Однако вследствие большой пластичности этой клеточной популяции, с одной стороны, ни один из маркеров не способен выявить все CAF, а с другой — описанные маркеры не являются специфичными и, помимо CAF, определяются в других клетках [16]. Так, FSP-1 также выявляется в покоящихся Ki-67-отрицательных фибробластах, макрофагах и некоторых опухолевых клетках; FAP также экспрессируется CD45-иммунными клетками и перицитами, десмин и PDGF выявляются на перицитах [2]. Помимо этого большинство маркеров, которые используются для оценки CAF, также характерно для нормальных активированных фибробластов. Так, например, αSMA — основной маркер CAF — экспрессируется в нормальных перикриптальных фибробластах [9], поэтому ориентироваться лишь на него и оценивать корреляцию прогноза и экспрессии этого маркера некорректно. Все вышеизложенное затрудняет идентификацию CAF.

В метаанализе корреляции между биомаркерами CAF молочной железы и региональными метастазами не идентифицированы специфические биомаркеры, которые можно было бы использовать для идентификации CAF молочной железы [17]. Вероятно, что сами CAF молочной железы являются гетерогенными, аналогично гетерогенности самих эпителиальных клеток рака молочной железы. Поэтому большинство авторов [18, 19] предлагают использовать комбинацию из нескольких вышеописанных маркеров для идентификации большей популяции CAF в опухоли. Способствует идее гетерогенности CAF и их двойственная роль в отношении прогрессии опухоли. Так, по некоторым данным, CAF сдерживает развитие панкреатической аденокарциномы, уменьшая фиброз и гипоксию, по другим — непосредственное удаление αSMA⁺CAF приводит к редукции фиброза и выживаемости мышей с панкреатической аденокарциномой [2]. Есть сведения, что CAF ингибируют пролиферацию эпителиальных клеток при сокультивировании in vitro [20]. В мелкоклеточном раке легкого подопланинэкспрессирующие CAF ингибируют рост опухолевых клеток при непосредственном (прямом) контакте [21]. Колокализация маркеров требует высокотехнологичного оборудования и соответствующих систем детекции, при которых можно будет оценивать наличие нескольких меток непосредственно в одной и той же клетке, что лимитирует количество исследований в данной области.

Предпринимаются попытки идентифицировать субпопуляции CAF и оценить их прогностическое значение. Так, показано, что подопланин⁻/αSMA^high CAF ассоциированы с более злокачественным типом опухолей и коротким безрецидивным периодом, в то время как подопланин⁻/FSP-1^high CAF – с лимфоваскулярной инвазией и «почкованием» (budding) опухоли, но не с прогнозом [22]. Несмотря на то что CAF, экспрессирующие FSP-1, участвуют в прогрессии опухоли, этот маркер очень неспецифичен и экспрессируется во многих других типах клеток преимущественного воспалительного ряда (лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы), в связи с чем крайне затруднена оценка FSP-1 именно в CAF, а не инфильтрате, и, соответственно, практическое значение FSP-1 вызывает сомнения.

Популяции CAF, выявленные с помощью различных маркеров, отличаются не только у опухолей разных локализаций, но и у разных гистологических типов. Так, в карциноме молочной железы неспецифического типа стромальные клетки в основном экспрессируют PDGFRα и NG2, а в инвазивной дольковой карциноме — PDGFRβ, FAP и FSP-1 [23].

Среди маркеров CAF прогностическое значение показано не для всех (табл. 2). В ряде исследований для маркеров αSMA, подопланина и FAP была обнаружена корреляция их экспрессии с неблагоприятными исходами рака легкого [21, 24—26], а для маркера CD99, наоборот [27]. Отрицательный FSP-1 и положительный подопланин являлись независимыми плохими прогностическими факторами в карциномах молочной железы [23]. В колоректальном раке было показано неблагоприятное влияние маркера FAP [28], однако в данном исследовании не подтверждалась экспрессия FAP именно в CAF, а также не оценивалось наличие данных FAP-позитивных CAF в лимфатических узлах.

Для оценки роли CAF в канцерогенезе, инвазивности опухоли и корреляции с клиническими характеристиками, такими как метастазирование, лимфоваскулярная инвазия, стадия, некоторые авторы оценивают отдельно CAF в центре опухоли и инвазивном крае (см. рис. 1, в, г). Однако, по данным G. Son и соавт. [43], различий между этими зонами в зрелости CAF и молекулярными маркерами выявлено не было. Экспрессия FSP-1 и незрелые CAF в инвазивном крае являлись неблагоприятными прогностическими факторами [43]. В исследовании R. Nishishita и соавт. [48] показана ассоциация между высокими уровнями αSMA и PDGFRβ и венозной инвазией.

В нормальной ткани подопланин экспрессируется в эндотелиальных клетках лимфатических сосудов, миоэпителиальных клетках молочной железы [49], базальном слое клеток сальных желез [50]. Есть данные о вовлечении подопланина в опухолевую прогрессию, участии в ЭМП, инвазии и метастазировании [22]. Прогностическое значение подопланина показано для многих типов опухолей: повышенная экспрессия отмечается в опухолевых клетках инвазивного края плоскоклеточных карцином, колоректальных аденокарцином, семиномы, мезотелиомы [51, 52]. Экспрессия подопланина также выявлена в CAF различных опухолей, в том числе колоректальном раке (рис. 2, a).

Большое исследование норвежских авторов [19] посвящено анализу корреляции различных маркеров CAF с иммунным статусом опухоли легкого, что является крайне актуальным, поскольку доказано участие CAF в привлечении и активации иммунных клеток микроокружения опухоли [2]. Обычно считается, что CAF оказывают иммуносупрессивное действие на микроокружение опухоли [2], хотя данное мнение спорно, поскольку в гипоксической нише опухолевые, эндотелиальные, иммунные клетки и CAF динамически взаимодействуют, увеличивая количество паракринных взаимодействий. В исследовании [19] показано, что высокая плотность FAP-позитивных CAF ассоциирована с лучшим прогнозом и высокой плотностью CD8- и CD3-лимфоцитов, что соответствует цитотоксичным Т-лимфоцитам.

Отдельного изучения заслуживают CAF в метастазах, иногда называемые фибробласты, ассоциированные с метастазами (metastasis-associated fibroblasts — MAF), которые описываются как реактивная фиброзная ткань с повышенным отложением фибронектина, витронектина, с десмоплазией, узловым фиброзом и гиалинизацией стромы [55]. Предполагается, что CAF продуцируют цитокины и факторы роста, прямо или косвенно стимулирующие миграцию опухолевых клеток [56]. MAF, экспрессирующие тенасцин С и VEGFA, являются ключевыми медиаторами метастазирования рака молочной железы в легкое [57]. По данным E. Olaso и соавт. [58], метастазы меланомы в печени предположительно активируют звездчатые клетки для обеспечения ангиогенеза. В колоректальном раке TGFb1-стимулированные CAF секретируют IL-11, повышая выживаемость опухолевых клеток и их склонность к колонизации [59]. Происхождение MAF также не установлено: CAF из первичной опухоли, пришедшие вместе с опухолевыми клетками, трансформация фибробластов вторичного органа или клеток костного мозга [3, 60]. Для метастазов колоректального рака в печени авторы склоняются к версии происхождения из печеночных звездчатых клеток и отмечают их схожую с CAF экспрессию αSMA [3]. Сравнительный анализ между первичной опухолью и метастазами в печени выявили схожий уровень αSMA в CAF [61], однако при сравнении между собой количество MAF в отдаленных метастазах легкого было существенно ниже, чем в печени, брюшине и яичнике [3]. Колоректальные раки с повышенной концентрацией CAF в центре первичной опухоли имели тенденцию к увеличению MAF по периферии метастаза [62].

Важным аспектом является участие CAF в развитии резистентности к терапии. Так, таргетная терапия FAP-позитивных CAF привела кухудшению выживаемости пациентов с колоректальным раком [63]. Подопланинпозитивные CAF играют важную роль в резистентности аденокарциномы легкого к ингибиторам тирозинкиназ EGFR (молекулярная таргетная терапия) [64]. Цитотоксичная терапия рака простаты также приводила к увеличению резистентности из-за активации Wnt-сигнального пути, а гормональная терапия рака молочной железы тамоксифеном — к резистентности из-за изменения CAF митохондриальной функции опухолевых клеток [8]. В качестве одного измеханизмов рассматривается CAF-зависимое увеличение давления внутриопухолевой интерстициальной жидкости, что приводит к ингибированию захвата противоопухолевых препаратов. По другим данным, CAF-ассоциированная иммунная модуляция, проангиогенные свойства и метаболическое репрограммирование опухолевого окружения могут помогать эпителиальным клеткам избегать терапевтического воздействия и повышать их выживаемость [65]. Есть и обратные данные оснижении резистентности к обычной химиотерапии благодаря мутации p53 в CAF, которая в свою очередь приводит к продукции факторов роста, нацеленных против опухолевых клеток [8]. Пероральная вакцина против FAP, действие которой опосредовано CD8+ T-лимфоцитами, продемонстрировала уменьшение прогрессирования первичной опухоли иметастазов у резистентных к множеству лекарственных препаратов карцином молочной железы и толстой кишки у мышей. Также после приема вакцины в первичной опухоли зафиксировано снижение коллагена I типа и увеличение накопления лекарственных препаратов на70% [66]. Есть данные о том, что печеночные CAF чувствительны кцитотоксичной терапии навитоклаксом, который индуцирует апоптоз избирательно в CAF, а не в покоящихся фибробластах и не в клетках холангиокарциномы [67].

В сумме все эти данные подтверждают гетерогенность CAF. По данным ряда авторов, выделяют до 4 различных типов CAF, ответственных за разные процессы [2] (рис. 3).

Исследование микроокружения опухолей стало актуальным направлением современной онкологии и молекулярной биологии. CAF являются компонентом стромы опухоли, играющим важную роль в пролиферации, инвазивности, метастазировании и опухолевом ангиогенезе. Однако прогностическое значение CAF не определено, не разработаны способы их идентификации. Выявление специфичных маркеров CAF, оценка их роли в канцерогенезе и разработка таргетных препаратов — важные этапы в развитии диагностики и лечения колоректального рака.

Работа выполнена в рамках госзадания ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова» с использованием оборудования, приобретенного по Программе развития ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова» до 2020 г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Олейникова Н.А. — https://orcid.org/ 0000-0001-8564-8874; e-mail:noleynikova@mc.msu.ru

Данилова Н.В. — https://orcid.org/ 0000-0001-7848-6707

Михайлов И.А. — https://orcid.org/ 0000-0001-8020-369X

Семина Е.В. — https://orcid.org/ 0000-0002-3927-9286

Мальков П.Г. — https://orcid.org/0000-0001-5074-3513