Псориаз — хроническое иммунологически обусловленное заболевание мультифакториальной природы [1, 2], поражающее 1—2% населения [3, 4] и при классическом течении характеризующееся рецидивирующими эпизодами появления шелушащихся четко очерченных бляшек красного цвета [5]. Патоморфологическая картина при псориазе детально описана и включает ряд характерных признаков: 1) утолщение эпидермиса вследствие ускоренной пролиферации и нарушенной дифференцировки кератиноцитов; 2) истончение или отсутствие зернистого слоя; 3) резкое расширение просветов сосудов поверхностного сплетения в сосочках дермы и 4) наличие плотных очаговых воспалительных инфильтратов, представленных преимущественно Т-лимфоцитами и дендритными клетками в дерме и CD8+ Т-лимфоцитами и нейтрофильными гранулоцитами в эпидермисе с агрегацией нейтрофилов в субкорнеальные спонгиоформные пустулы Когоя и микроабсцессы Мунро в паракератотических чешуйках [5, 6]. Клеточный состав воспалительного инфильтрата при псориазе отчетливо указывает на иммуноопосредованное воспаление, однако клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе патофизиологических изменений в коже, стали объектом пристального изучения лишь с начала 2000-х годов, одновременно с успешным развитием возможностей таргетной терапии.

Первые исследования патогенеза псориаза показали важную роль иммунной системы и в особенности Т-лимфоцитов [7]. Было доказано, что доминирующей субпопуляцией Т-клеток в псориатических бляшках являются Т-хелперные кетки 1-го типа (Th1-клетки), дифференцировка которых запускается посредством IL-12 [8]. Недавно была выявлена новая субпопуляция Т-лимфоцитов, экспрессирующих IL-17, Т-хелперные клетки 17-го типа (Th17-клетки), количество которых оказалось резко повышено в коже на участках формирования псориатических бляшек [8, 9]. В исследованиях на мышиной модели показано уменьшение количества Th1-клеток и увеличение количества Th17-клеток в коже в области псориатических бляшек, а также смещение цитокинового состава в сторону повышения экспрессии IL-17 [7, 10].

Th17-клетки представляют собой CD4+ эффекторные Т-хелперные клетки, отличающиеся от Th1- и Th2-клеток способностью продуцировать большие количества IL-17A, что определяет их роль в обеспечении адаптивного иммунитета к патогенам [10]. Th17 дифференцируются из наивных Т-клеток (Th0) под влиянием различных факторов: TGF-β, IL-6, IL-21, IL-1β [11]. В дальнейшем Th17-клетки активируются посредством IL-23, IL-1β, IL-21 и начинают продуцировать множество провоспалительных факторов, помимо IL-17A, в том числе IL-17 °F и IL-22 [12]. Помимо Th17-клеток IL-17 (а также IL-21 и IL-22) в псориатических очагах вырабатывается и субпопуляцией цитотоксических T-клеток (Tc17) [7].

Дифференцировка Th17 запускается посредством IL-23. Особенно важно, что в структуре как IL-12, так и IL-23 присутствует общая субъединица p40, причем ингибирование субъединицы IL-12/23р40 так же эффективно, как и ингибирование изолированно IL-23, что свидетельствует о доминантной роли IL-23 и активации Th17-пути (а не IL-12 и Th1-пути, как ранее предполагалось) при псориазе [13].

IL-17 представляет собой группу молекул семейства цитокинов, включающую прототипический лиганд IL-17A и 5 других лигандов (от IL-17B до IL-17F) [14—17].

IL-17 относится к провоспалительным цитокинам и участвует во многих этапах иммунного ответа. IL-17A воздействует на различные типы клеток, включая эндотелиальные клетки, фибробласты, хондроциты, синовиальные клетки, моноциты и эпителиальные клетки, в том числе кератиноциты [18]. IL-17A и IL-17 °F воздействуют непосредственно на кератиноциты и стимулируют выработку ряда молекул, уровень которых поднимается в очагах псориаза, таких как цитокины, β-дефензины, антимикробные пептиды (AMPs) и хемокины, привлекающие нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты (IL-8, CCL20, CCl2 соответственно) [19]. Недавно было показано, что IL-17C воздействует на кератиноциты сходным с IL-17A и IL-17 °F образом, вызывая продукцию ими β-дефензина 2 (hBD2) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора [17]. IL-17E (IL25) разительно отличается от IL-17A, IL-17C и IL-17 °F тем, что вырабатывается преимущественно эпителиальными клетками в процессе развития аллергического ответа и вызывает активацию Th2-ответа [16, 20]. Экспрессия IL-17E (IL-25), IL-17 В и IL-17D не повышается в очагах псориатических бляшек по сравнению с непораженной кожей, и, таким образом, указанные цитокины наиболее вероятно не играют важной роли в развитии псориаза [21].

Эффективность ингибирования IL-23 превысила таковую при ингибровании каждого из отдельных лигандов IL-17, однако оказалась сходной с ингибированием рецептора к IL-17 типа A, а также с эффективностью совместного ингибирования IL-17A и IL-17C, тогда как ингибирование IL-17 °F (отдельно или совместно с другими лигандами IL-17) не оказывало значимого действия [13].

Ряд исследований посвящен изучению клеток, экспрессирующих IL-17A в очагах поражения при псориазе, так как они могут быть представлены не только Т-хелперными клетками, но и CD8+ Т-клетками (Tc17), тучными клетками или нейтрофильными гранулоцитами [9, 22, 23]. Взаимодействие этих различных клеточных типов крайне важно для понимания их роли в патогенезе псориаза.

Тучные клетки относятся к системе врожденного иммунитета и инфильтрируют кожу в очагах поражения на ранних сроках формирования псориатических бляшек [24]. Они продуцируют провоспалительные факторы, включая IL-8, IL-22 и IL-17. Была показана способность тучных клеток экспрессировать мРНК, кодирующие IL-22 и IL-17, а также высвобождать указанные цитокины в процессе формирования внеклеточных ловушек или при дегрануляции в случае IL-17 под воздействием IL-23 и IL-1b [23, 24]. Роль тучных клеток в экспрессии IL-17 крайне противоречива и плохо изучена. По результатам одних исследований, тучные клетки являются основным источником IL-22 в очагах поражения, тогда как IL-17 в большей степени экспрессируется Т-клетками [24]. По результатам, полученным другими группами ученых, тучные клетки являются одним из основных источников IL-17 в очагах поражения при псориазе, так же как и в коже здоровых лиц [23].

Нейтрофилы инфильтрируют дерму на ранних стадиях формирования псориатической бляшки, впоследствии мигрируя в эпидермис, образуя микроабсцессы Мунро, являющиеся одним из характерных гистопатологических признаков заболевания. Нейтрофилы представляют собой важный источник провоспалительных медиаторов, включая IL-17, который одновременно является фактором, стимулирующим их выживание, привлечение в очаг воспаления (хемотаксис) и активацию [23]. Таким образом, экспрессия ими IL-17 является своеобразным важным аутокринным аутоамплификационным сигналом [25]. Неоднократно описано наличие IL-17 в цитоплазматических включениях в нейтрофилах, однако крайне спорным остается вопрос, экспрессируют ли нейтрофилы мРНК, кодирующую IL-17 [26—28]. На сегодняшний день большинство авторов склоняются к тому, что нейтрофилы являются резервуаром для IL-17, продуцируемого иными клетками, который запасается в цитоплазме и высвобождается во внеклеточное пространство во время их активации и формирования нейтрофильной внеклеточной ловушки. Показана секреция IL-17 нейтрофилами под влиянием не только IL-23, но и IL-6 [23, 25].

Цель исследования — изучить экспрессию IL-17A клетками воспалительного инфильтрата в бляшках как одного из ключевых звеньев патологического процесса при среднетяжелом и тяжелом псориазе.

Исследование представляло собой один из этапов работы в соответствии с полученным ФГБУ ГНЦДК Минздрава России грантом «Прогнозирование ответа на таргетную терапию среднетяжелого и тяжелого псориаза» (Соглашение № 18−15−00372, срок выполнения работы 2018—2020 гг.), в него были включены 50 больных псориазом.

При клиническом осмотре каждого из пациентов отмечали возраст и длительность течения заболевания, проводили оценку общего состояния (Investigators’ Global Assessment — IGA), учитывающую выраженность эритемы и инфильтрации бляшек, наличие корок и экскориаций.

У всех больных диагноз псориаза был подтвержден при рутинном патогистологическом исследовании с окрашиванием препаратов гематоксилином и эозином.

Состав воспалительного инфильтрата изучали с использованием реакции иммунофлюоресценции (РИФ), проводимой по непрямой методике с использованием первичных и вторичных антител. Непрямую РИФ проводили в соответствии со стандартным протоколом. Применяли первичные антитела к CD3 (маркер Т-лимфоцитов) — rabbit monoclonal antibody [SP7] (Abcam, США), CD11с (маркер дендритных клеток) — rabbit monoclonal antibody [EP1347Y] (Abcam, США), Ki-67 (маркер пролиферации) — rabbit polyclonal antibody (Abcam, СШA) к миелопероксидазе нейтрофильных гранулоцитов (Mpo) — mouse monoclonal antibody [2C7] (Abcam, СШA) и к триптазе тучных клеток (Trp) — mouse monoclonal antibody [AA1] (Abcam, СШA). Для изучения экспрессии IL-17А использовали rabbit anti-IL-17A polyclonal antibody (Abcam, СШA). С целью выявления указанных маркеров методом иммунофлюоресценции применяли вторичные антитела (класса IgG): goat anti-rabbit polyclonal antibody DyLight 488 (GeneTex, СШA) (флюоресценция наблюдается в зеленом диапазоне при воздействии лазерного света с длиной волны 488 нм) и goat anti-mouse polyclonal antibody DyLight 633 (GeneTex, США) (флюоресценция наблюдается в красном диапазоне при воздействии лазерного света с длиной волны 633 нм). Для заключения препаратов под покровное стекло использовали среду, содержащую нуклеотидспецифичный флюорохром DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) (Fluoroshield with DAPI, Sigma-aldrich, СШA), флюоресцирующий в синем диапазоне при воздействии лазерного света с длиной волны 405 нм. Свечение флюорохромов определяли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа ex vivo Оlympus IX81S1F-S (Германия).

Количество клеток, положительно окрашенных каждым из указанных маркеров, оценивали посредством подсчета в поле зрения при увеличении в 200 раз, а также их среднего числа в 3 полях зрения.

При изучении количества нейтрофильных гранулоцитов и тучных клеток, экспрессирующих IL-17A, использовали двойную метку: при наложении красного (маркеры Mpo или Trp) и зеленого (соответствующего IL-17A) свечения выявляли желтое свечение, свидетельствующее о совместном присутствии двух антигенов в данной клетке.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Statistica 10.0. Статистическую корреляцию количества клеток каждого типа с экспрессией IL-17A, с одной стороны, и показателем IGA — с другой, оценивали с использованием U-критерия Манна—Уитни. Связь количества клеток каждого типа и экспрессии IL-17A, с одной стороны, и остальными показателями (возрастом, длительностью заболевания и индексом PASI) — с другой, оценивали с помощью ранговых корреляций Спирмена.

Возраст больных псориазом в исследуемой выборке из 50 пациентов составил от 26 до 76 лет, длительность заболевания — от 4 до 43 лет. Общая оценка тяжести состояния врачом (IGA) составляла 3 (среднетяжелый псориаз) или 4 (тяжелый псориаз).

При рутинном гистологическом исследовании с окрашиванием препаратов гематоксилином и эозином у всех больных диагноз псориаза был подтвержден на основании выявления характерных морфологических признаков: равномерного удлинения и булавовидного утолщения гребней, истончения или отсутствия зернистого слоя, пролиферации капилляров поверхностного сплетения в сосочках, воспалительного инфильтрата с наличием лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов и их экзоцитозом в эпидермис с формированием в 74% случаев (у 37 больных из 50) микроабсцессов Мунро (рис. 1).

Клетки воспалительного инфильтрата преимущественно обнаруживали в сосочковом слое дермы, с незначительно выраженным проникновением в более глубокие отделы. Mpo+ клетки (нейтрофильные гранулоциты), помимо сосочков дермы, выявляли в виде единичных рассеянных клеток в толще эпидермиса, местами группируемых в небольшие агрегаты в верхних рядах шиповатого слоя (субкорнеально), что соответствовало локализации микроабсцессов Мунро при гистологическом исследовании (рис. 2).

Большинство клеток воспалительного инфильтрата в сосочковом слое дермы было представлено Т-лимфоцитами (CD3+) (рис. 3),

При исследовании статистических корреляций (см. таблицу)

Полученные данные показали, что у больных псориазом среднетяжелого и тяжелого течения выраженность клинических проявлений заболевания (эритемы, корок, инфильтрации бляшек) в определенной мере обусловлена уровнем продукции IL-17A. Учитывая, что IL-17A обладает способностью регулировать продукцию цитокинов, индуцируя экспрессию провоспалительных медиаторов: колониестимулирующих факторов (GM-CSF, G-CSF) CXC — хемокинов (CXCL1 CXCL2, CXCL5, CXCL7, IL-8), металопротеиназ, IL-6, антимикробных пептидов [10, 13], подобные результаты вполне закономерны. Вероятно, при участии IL-17А происходит рекрутирование клеток воспалительного ряда, прежде всего нейтрофильных гранулоцитов, в очаг воспаления за счет его способности увеличивать экспрессию таких костимуляторных молекул, как inter-cellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), которые, в свою очередь, участвуют в усилении Т-клеточной активации [9]. Другой ключевой мишенью для IL-17A являются кератиноциты, воздействие на которые приводит к усилению пролиферации эпидермиса [13, 17].

При среднетяжелом и тяжелом течении псориаза клиническому прогрессированию заболевания (появлению новых бляшек и усилению их инфильтрации) соответствует морфологическая картина с наличием большого количества нейтрофильных гранулоцитов, с их выраженным тропизмом к эпидермису и формированием множественных микроабсцессов Мунро [2—6], что нехарактерно для хронического (стационарного) периода псориаза. Вероятно, это может объяснить отсутствие корреляционных связей между количеством Т-лимфоцитов и тяжестью патологического процесса. Можно предположить, что Т-лимфоциты играют основную роль прежде всего не в инициации, а в поддержании и хронизации воспалительного процесса и персистировании иммунных реакций.

В нормальной коже основным источником IL-17А являются тучные клетки [13, 24] и лишь единичные нейтрофильные гранулоциты, в очагах псориатических бляшек не только увеличивается количество нейтрофильных гранулоцитов, но и, вероятно, они принимают на себя ключевую роль по экспрессии IL-17А, тогда как значимость тучных клеток снижается. В то же время нельзя исключить и то, что в условиях гиперпродукции IL-17А нейтрофильные гранулоциты берут на себя функцию по его утилизации [27]. Это вопрос, который требует дальнейшего изучения.

Учитывая, что дендритные клетки представляют собой уникальные антигенпрезентирующие клетки, регулирующие антигенспецифический иммунный ответ, медиаторами которого являются Т-лимфоциты и Т-зависимые В-лимфоциты [20], корреляция их количества с длительностью заболевания представляется вполне закономерной.

Отрицательная корреляция уровня Ki-67 с возрастом пациентов (рис. 7, а,

Результаты проведенного исследования подтверждают ключевую роль IL-17A, в значительной степени экспрессируемого нейтрофильными гранулоцитами, в патогенезе псориаза. В то же время остается много неясных моментов, касающихся роли различных клеток воспалительного ряда в продукции и утилизации IL-17A в различные периоды заболевания. Необходимо продолжение исследования для подтверждения результатов на большей группе пациентов, а также для решения вопроса о целесообразности применения таргетной анти-IL-17A-терапии в лечении среднетяжелого и тяжелого псориаза.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.А.С., А.Э.К.

Сбор и обработка информации — А.Э.К., М.А.Н.

Статистическая обработка — М.А.Н.

Написание текста — М.А.Н.

Редактирование — В.А.С.

Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 18−15−00372 «Прогнозирование ответа на таргетную терапию среднетяжелого и тяжелого псориаза».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Смольянникова В.А. — https://orcid.org/0000-0001-5699-5308; e-mail: smva@bk.ru

Карамова А.Э. — https://orcid.org/0000-0003-3805-8489

Нефедова М.А. — https://orcid.org/0000-0003-1141-9352