Тертычный А.С.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия ,

Ахриева Х.М.

кафедра факультетской терапии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Ингушский государственный университет», Назрань, Россия

Зайратьянц О.В.

кафедра патологической анатомии Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова Минздрава России, Москва, Россия, 127473

Селиванова Л.С.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России, Москва, Россия

Бирг Т.М.

ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России ул. 4-я Тверская-Ямская, 16, Москва, Россия, 125047

Экспрессия рецепторов к соматостатину в слизистой оболочке подвздошной кишки у больных с воспалительными заболеваниями кишечника

Журнал: Архив патологии. 2016;78(1): 19-24

Просмотров : 347

Загрузок : 3

Как цитировать

Тертычный А. С., Ахриева Х. М., Зайратьянц О. В., Селиванова Л. С., Бирг Т. М. Экспрессия рецепторов к соматостатину в слизистой оболочке подвздошной кишки у больных с воспалительными заболеваниями кишечника. Архив патологии. 2016;78(1):19-24.
Tertychny A S, Akhrieva Kh M, Zairat’yants O V, Selivanova L S, Birg T M. Somatostatin receptor expression in the ileal mucosa of patients with inflammatory bowel disease. Arkhiv Patologii. 2016;78(1):19-24.
https://doi.org/10.17116/patol201678119-24

Авторы:

Тертычный А.С.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия ,

Все авторы (5)

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуются развитием хронического рецидивирующего воспаления и включают две нозологические формы: болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Этиология и патогенез этой группы заболеваний все еще остаются неясными. В случаях, когда провести дифференциальный диагноз между БК и ЯК не представляется возможным, ставят диагноз неопределенного или неклассифицируемого колита (НК) у больного с ВЗК. Полагают, что причиной ВЗК является патологическая реакция иммунной системы в ответ на воздействие микроорганизмов на слизистую оболочку кишечника у генетически предрасположенных лиц [1]. В патогенезе ВЗК обсуждаются значение нейроэндокринно-иммунных взаимодействий и нарушения регуляторной деятельности диффузной эндокринной системы кишечника, в частности была показана роль соматостатина как одного из нейропептидов с противовоспалительным действием [2—4].

Цель исследования — изучение экспрессии рецепторов к соматостатину (РС) в клетках слизистой оболочки подвздошной кишки при БК и НК по сравнению с неизмененной слизистой оболочкой. В исследование не были включены больные с диагнозом ЯК в связи с особенностями взятия материала для морфологического исследования из наиболее пораженных дистальных отделов толстой кишки у пациентов с ЯК.

Материал и методы

Изучены биоптаты подвздошной кишки 42 больных, из них у 16 была клинико-морфологически подтвержденная БК, а у 14 провести дифференциальный диагноз между БК и ЯК на момент исследования не представлялось возможным, в результате чего был поставлен диагноз НК. В качестве группы сравнения исследованы биоптаты 12 пациентов без ВЗК с неизмененной слизистой оболочкой подвздошной кишки (данным пациентам была проведена колоноскопия для исключения воспалительного процесса или опухоли). Возраст больных колебался от 22 до 55 лет (средний — 38±6 года). Ни один из пациентов до проведения эндоскопического исследования не проходил лечение по поводу ВЗК. В каждом наблюдении исследовали в среднем три биоптата из наиболее пораженных участков подвздошной кишки.

После рутинного гистологического исследования биоптатов проводили ИГХ-реакцию с использованием аппарата для автоматического окрашивания Bond («Leica Biosystems», Германия) и моноклональных кроличьих антител к РС 2-го типа (Somatostatin receptor type 2, клон EPR3507, разведение 1:200, «Epitomics», США). Также проведено ИГХ-исследование серийных срезов илеобиоптатов с антителами к хромогранину, А (NCL-CHROM-430, клон 5H7, разведение 1:200, «Leica Biosystems», Германия) для оценки изменений нейроэндокринной системы подвздошной кишки и антителами к CD3 (NCL-L-CD3−565, клон LN10, разведение 1:500, «Leica Biosystems», Германия) — маркеру, специфичному для всех субпопуляций Т-лимфоцитов.

Среди отсканированных на слайд-сканере Aperio AT2 («Leica Biosystems», Германия) препаратов отбирали слайд-сканы для последующего количественного подсчета РС-2 позитивно окрашенных клеток. Полученные цифровые изображения также позволили провести сопоставление изображений и выполнить измерения размера клеток и структур слизистой оболочки с помощью программы Aperio Imagescope («Leica Biosystems», Германия). Среднее количество областей, выбранных для подсчета позитивно окрашенных клеток, обнаруживаемых среди клеток эпителия ворсин в каждом из биоптатов, составило 10. Помимо общего числа РС-2-позитивных клеток, проводили подсчет клеток в зависимости от особенностей окрашивания. Пересчет полученных результатов проводили на 100 эпителиальных клеток, покрывающих поверхность ворсин слизистой оболочки.

Полученные данные обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0. Для статистического анализа применяли непараметрические методы. Статистическую достоверность полученных результатов определяли с помощью двустороннего критерия Манна—Уитни. Средние значения представляли в виде медианы (М) и интерквартильного размаха (ИК). Различия считали достоверными при p<0,05. Полученные с использованием этого метода данные представляли в виде диаграмм размаха, на которых показаны медиана, границы 1-го и 3-го квартилей и 9-й и 91-й процентили.

Результаты и обсуждение

Результаты проведенного исследования показали, что клетки, позитивно окрашенные антителами к РС 2-го типа, локализовались преимущественно на поверхности ворсин, а также в криптах (рис. 1). Кроме того, позитивно окрашенные клетки выявлены в собственной пластинке слизистой оболочки среди клеток инфильтрата, при этом они располагались в основном одиночно или образуя небольшие скопления (рис. 2). Отмечалось позитивное окрашивание центров лимфоидных фолликулов в виде сети и ганглиозных клеток подслизистого слоя, если они обнаруживались в биоптате (рис. 3, 4).

Рис. 1. Болезнь Крона. Среди эпителиоцитов, выстилающих ворсину слизистой оболочки подвздошной кишки, большое число клеток, экспрессирующих рецепторы соматостатина 2-го типа. Позитивно окрашенные клетки отличаются различной формой и размерами, а также интенсивностью окрашивания мембраны и цитоплазмы. ИГХ-исследование, непрямой иммунопероксидазный метод. ×400.

Рис. 2. Болезнь Крона. Клетки, экспрессирующие рецепторы соматостатина 2-го типа, локализуются не только в криптах слизистой оболочки подвздошной кишки, но и в собственной пластинке среди клеток воспалительного инфильтрата. ИГХ-исследование, непрямой иммунопероксидазный метод. ×400.

Рис. 3. Неопределенный (неклассифицируемый) колит. Лимфоидный фолликул с крупным центром размножения в слизистой оболочке подвздошной кишки. Экспрессия рецепторов к соматостатину 2-го типа клетками центра размножения, формирующими сеть, и единичными клетками, расположенными среди эпителия, прилежащего к лимфоидному фолликулу, а также в эпителии крипт. ИГХ-исследование, непрямой иммунопероксидазный метод. ×200.

Рис. 4. Неизмененная слизистая оболочка подвздошной кишки. Экспрессия рецепторов соматостатина 2-го типа ганглиозными клетками. ИГХ-исследование, непрямой иммунопероксидазный метод. ×400.

Подсчет всех клеток, позитивно окрашенных антителами к РС 2-го типа на 100 эпителиоцитов слизистой оболочки, покрывающих поверхность ворсин, продемонстрировал, что при БК число таких клеток колебалось от 3 до 29 (М=11, ИК=8). При Н.К. их количество составило от 2 до 19 (М=5, ИК=3), а в группе сравнения — от 2 до 29 (М=8, ИК=5,5) (рис. 5). Следовательно, медиана числа клеток с РС 2-го типа уменьшалась в ряду БК—норма—Н.К. При статистическом сравнении полученных данных различия в группах оказались достоверными (р<0,05). Большинство проведенных ранее исследований было направлено на анализ клеток, продуцирующих соматостатин, а не экспрессирующих РС [2, 4]. В этих работах было выявлено, что при ВЗК, особенно у больных с ЯК, значительно уменьшается число соматостатинсодержащих клеток преимущественно в дистальных отделах ободочной кишки. Подобных различий между БК и неизмененной слизистой оболочкой обнаружено не было [2].

Рис 5. Число клеток, экспрессирующих рецепторы соматостатина 2-го типа, при БК, НК и в неизмененной слизистой оболочке подвздошной кишки в пересчете на 100 эпителиальных клеток, покрывающих ворсину, и статистические различия между группами. Здесь и на рис. 6—8: данные представлены в виде диаграммы размаха: медиана, границы 1-го и 3-го квартилей (границы «ящика»), 9-й и 91-й процентили (концы «усов»).

При более детальном изучении препаратов, полученных в результате ИГХ-исследования, отмечены различия в форме и размерах позитивно окрашенных клеток, а также характере экспрессии РС 2-го типа.

В первую очередь обращала на себя внимание разная форма позитивно окрашенных клеток, большинство из которых имело цилиндрическую или кубическую форму (диаметр этих клеток равен в среднем 12±4 мкм). Второй тип представлен клетками вытянутой неправильной или треугольной формы (средний диаметр 20±5 мкм). Третий тип клеток отличался округлой формой и средним диаметром 4±2 мкм.

Выделено три варианта экспрессии РС 2-го типа: преимущественно мембранная, цитоплазматическая и смешанная, мембранно-цитоплазматическая. Для первого варианта характерны подчеркнутый контур мембраны клетки и отсутствие окрашивания цитоплазмы, при втором — интенсивность экспрессии настолько выражена, что вся клетка вместе с ее мембраной приобретает равномерную и однородную интенсивную коричневую окраску. Третий отличался окрашиванием цитоплазмы с подчеркнуто интенсивно окрашенной мембраной клетки (см. рис. 1).

Подсчет позитивно окрашенных клеток с мембранной экспрессией РС 2-го типа показал, что медиана этого показателя при БК составила 1 (М=1, ИК=0,5), при НК — 3 (М=3, ИК=2,5), а в группе сравнения — 2 (М=2, ИК=2) (рис. 6). Следовательно, медиана числа клеток с мембранной экспрессией РС 2-го типа уменьшалась в ряду НК—норма—БК (р<0,05), при этом общее число клеток, позитивно окрашенных с антителами к РС 2-го типа, при НК оказалось наименьшим, а при БК — наибольшим. Согласно проведенному исследованию с антителами к хромогранину, А (универсальный маркер нейроэндокринных клеток), при ВЗК число таких клеток также было наибольшим при НК (М=15, ИК=6) и превышало данный показатель при БК (М=13, ИК=5) (р<0,05).

Рис. 6. Число клеток, экспрессирующих рецепторы соматостатина 2-го типа, при БК, НК и в неизмененной слизистой оболочке подвздошной кишки в пересчете на 100 эпителиальных клеток, покрывающих ворсину, с мембранным вариантом окрашивания и статистические различия между группами.

Для того чтобы показать, что клетки с мембранной экспрессией РС 2-го типа являются нейроэндокринными, проведено сравнение их локализации с клетками, окрашенными антителами к хромогранину, А с помощью отсканированных изображений серийных срезов тех же биоптатов. На полученных цифровых изображениях локализация клеток с мембранной экспрессией РС 2-го типа совпала с нейроэндокринными клетками, положительно окрашенными антителами к хромогранину А. Однако количество клеток с мембранной экспрессией РС 2-го типа оказалось значительно меньшим, чем общее число всех хромогранин А-позитивных клеток. Полученные результаты объясняются тем, что хромогранин, А является универсальным маркером для нейроэндокринных клеток, которые участвуют в синтезе не только соматостатина, но и других нейропептидов.

При втором варианте окрашивания обнаружено, что количество клеток с цитоплазматической экспрессией РС 2-го типа при БК составило от 1 до 3 (М=1, ИК=2), минимальное и максимальное количество подобным образом окрашенных клеток при НК — от 1 до 7 (М=3, ИК=2). В неизмененной слизистой оболочке количество этих клеток составило от 1 до 3 (М=2, ИК=1), таким образом, данный показатель оказался максимальным при НК, меньше — в неизмененной слизистой оболочке и еще меньше — при БК (р<0,05) (рис. 7). Клетки с таким окрашиванием по своей форме преимущественно мелкие и округлые, со средним диаметром 4±2 мкм. Учитывая особенности морфологии позитивно окрашенных клеток по цитоплазматическому типу и их наибольшее число при НК, можно предположить, что они представляют собой иммунные клетки, в частности лимфоциты. Для подтверждения данной гипотезы проведено сравнение цифровых изображений серийных срезов препаратов, окрашенных с использованием антител к РС 2-го типа, с препаратами, окрашенными с применением антител к CD3 для выявления интраэпителиальных Т-лимфоцитов. При этом наблюдалось совпадение окрашенных клеток по локализации. В дополнение к этому наибольшее число CD3+-клеток также наблюдалось при НК по сравнению с Б.К. Таким образом, цитоплазматически окрашенные, расположенные среди эпителия темные мелкие клетки скорее всего представляют собой Т-лимфоциты, мигрирующие из стромы к поверхности подвздошной кишки. Учитывая особенности влияния соматостатина на иммунные клетки в виде торможения их пролиферации и синтеза ими провоспалительных цитокинов [5], можно предположить, что экспрессия РС 2-го типа лимфоцитами играет роль в подавлении воспалительного процесса. При Б.К. нарушается нейрогуморально-иммунная регуляция воспаления, о чем свидетельствует уменьшение экспрессии РС 2-го типа на мембране иммунных клеток-эффекторов. Как следствие снижается противовоспалительный эффект соматостатина, повышается пролиферация лимфоцитов и продукция ими провоспалительных медиаторов, которая поддерживает воспалительный процесс.

Рис. 7. Число клеток, экспрессирующих рецепторы соматостатина 2-го типа, при БК, НК и в неизмененной слизистой оболочке подвздошной кишки в пересчете на 100 эпителиальных клеток, покрывающих ворсину, с цитоплазматическим вариантом окрашивания и статистические различия между группами.

Большинство клеток отличалось смешанной, мембранно-цитоплазматической, экспрессией РС 2-го типа. При Б.К. подобное окрашивание наблюдалось среди клеток в количестве от 1 до 12 (М=5, ИК=4), при НК оно составило от 1 до 11 (М=2, ИК=3). В неизмененной слизистой оболочке число этих клеток колебалось от 1 до 5 (М=3, ИК=2). Таким образом, количество позитивно окрашенных таким образом клеток максимально при БК, меньше в неизмененной слизистой оболочке и еще меньше при НК (рис. 8). Такое распределение характерно и для всех клеток, экспрессировавших РС 2-го типа. По своей форме большинство клеток со смешанной экспрессией РС 2-го типа представляло собой кубические или цилиндрические, мало отличающиеся от окружающих энтероцитов, однако среди них встречались клетки треугольной или неправильной формы. В результате сравнения отсканированных цифровых изображений серийных срезов обнаружено, что некоторые клетки с мембранно-цитоплазматической экспрессией РС 2-го типа совпали по локализации и форме с хромогранин-А-позитивными клетками. Это указывает на возможность окрашивания нейроэндокринных клеток не только по мембранному, но и по смешанному варианту. Согласно механизму интернализации [7], эти нейроэндокринные клетки являются, по-видимому, клетками, в которых РС уже связались со своим агонистом соматостатином. Большее число клеток с таким окрашиванием наблюдается при БК, тогда как количество мембранно-окрашенных клеток (нейроэндокринные клетки, РС которых не связаны с соматостатином) при БК наименьшее. Полученные результаты ставят под сомнение целесообразность лечения пациентов с БК аналогами соматостатина [8], так как количество клеток, которые смогут прореагировать с его агонистами, при этом заболевании наименьшее.

Рис. 8. Число клеток, экспрессирующих рецепторы соматостатина 2-го типа, при БК, НК и в неизмененной слизистой оболочке подвздошной кишки в пересчете на 100 эпителиальных клеток, покрывающих ворсину, с мембранно-цитоплазматическим вариантом окрашивания и статистические различия между группами.

Большое число клеток с мебранно-цитоплазматическим окрашиванием при реакции с антителами к РС 2-го типа не совпало по локализации и форме с хромогранин-А-позитивными нейроэндокринными клетками. Такие клетки отличались правильной призматической формой, такой же, как и соседние энтероциты. По-видимому, они и являются энтероцитами с РС 2-го типа. Действия соматостатина многогранны и, помимо действия как противовоспалительного нейромедиатора на клетки иммунной и нейроэндокринной систем, он также способен тормозить пролиферацию клеток, в том числе и энтероцитов, подавлять регенерацию поверхностного эпителия, способствовать его дифференцировке и созреванию [9, 10].

Заключение

Таким образом, в слизистой оболочке подвздошной кишки общее число клеток, экспрессирующих РС 2-го типа, уменьшается в ряду БК — неизмененная слизистая оболочка — Н.К. Выявлено три варианта экспрессии РС 2-го типа — преимущественно мембранная, цитоплазматическая и смешанная, мембранно-цитоплазматическая. Число клеток с мембранным окрашиванием уменьшается в ряду НК — неизмененная слизистая оболочка — БК; с цитоплазматическим и мембранно-цитоплазматическим — в ряду БК — неизмененная слизистая оболочка — НК. По-видимому, клетки с мембранным типом экспрессии РС 2-го типа являются нейроэндокринными, с цитоплазматическим — интраэпителиальными Т-лимфоцитами, с мембранно-цитоплазматическим — как нейроэндокринными, так и эпителиальными. Проведенное исследование подтверждает, что патогенез ВЗК связан с нарушением нейроэндокринно-иммунного взаимодействия. Анализировать нарушения нейроэндокринной и иммунной систем необходимо не изолированно друг от друга, а комплексно. Начальные изменения нейропептидной регуляции скорее всего представляют собой защитный механизм в ответ на повреждение. Однако дальнейшие изменения могут способствовать возникновению и поддержанию хронического воспалительного процесса.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.С.Т., Х.М.А., О.В.З.

Сбор и обработка материала: Л.С.С., Т.М.Б.

Статистическая обработка данных: Л.С.С.

Написание текста: Т.М.Б., Х.М.А.

Редактирование: О.В.З.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail