Меланома кожи занимает лидирующее положение среди новообразований с непрогнозируемым течением, высоким уровнем смертности и низкой эффективностью терапии диссеминированных форм [1]. Рост заболеваемости меланомой регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России [2], в связи с чем поиск молекулярных мишеней регуляции роста и метастазирования этого новообразования с целью дальнейшего возможного терапевтического воздействия является весьма актуальным.

Важная роль в развитии злокачественных новообразований отводится матриксным металлопротеиназам (ММП) [3, 4]. Эти цинксодержащие ферменты играют ведущую роль в обмене белков соединительной ткани, в процессах развития и ремоделирования внеклеточного матрикса, эмбриогенезе, репарации тканей, неоангиогенезе [3]. Особые функции в канцерогенезе выполняют ММП-9 и ММП-13. Повышение уровня данных ферментов в первичной опухоли и/или метастазах, в том числе и при меланоме кожи, позитивно связано с такими характеристиками, как низкая дифференцировка опухолевых клеток, высокая инвазивность и метастатическая активность, неблагоприятный прогноз, сокращение продолжительности жизни [5, 6]. Одними из источников ММП являются Т-лимфоциты и макрофаги, функциональная роль которых в опухолевой прогрессии, сопровождающейся синтезом и высвобождением данных ферментов, требует дальнейших разъяснений [7].

В качестве возможных модуляторов межклеточных взаимодействий в опухоли рассматриваются микроРНК. МикроРНК — класс некодирующих РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов. МикроРНК обладают способностью влиять на процессы трансляции и деградации матричных РНК, тем самым играя важную роль в регуляции биологического поведения клеток и тканей, в которых они экспрессируются. Они регулируют различные клеточные функции, в том числе пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [8]. Все микроРНК в зависимости от их функциональной роли разделяют на несколько кластеров, включающих группу онкомикроРНК, изменения экспрессии или функции которых регистрируются преимущественно при канцерогенезе. К ним относят микроРНК-21 (miR-21) — онкомикроРНК, принимающую участие в регуляции клеточной пролиферации, апоптоза, метастатического поведения многих злокачественных опухолей — рака поджелудочной железы, глиомы, меланомы и др. [8—10], а также микроРНК-let-7b (miR-let-7b) — онкомикроРНК, имеющую прогностическое значение при раке молочной железы, лейкозах, осуществляющую регуляцию апоптоза и ангиогенеза [11, 12].

Цель работы — оценить изменения динамики роста первичных опухолевых узлов, выраженности лимфоцитарной инфильтрации, а также уровней экспрессии онкомикроРНК miR-21 и miR-let-7b при ингибировании матриксных металлопротеиназ 9-го и 13-го типов in vivo.

Исследование проводилось на лабораторных животных — мышах линии С57Bl6. Перед проведением экспериментальных работ с животными было получено разрешение локального этического комитета и биоэтической комиссии Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (№ 44/2012 от 15.11.12). Все исследования проводили в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава Р.Ф. № 708н от 23.08.10 «Об утверждении правил лабораторной практики».

В эксперименте использовали мышей линии C57Bl6 — половозрелых самок в возрасте 8—10 нед, массой от 19 до 26 г, с перевитой меланомой B16, которые случайным образом были разделены на 3 группы — контрольную (n=16) и две опытные (n=7 в каждой группе). Животных содержали при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище.

На 10-й день после трансплантации опухолевых клеток животным в обеих опытных группах начата терапия ингибитором ММП-9 (MMP-9 Inhibitor I, «Calbiochem», США) в различных дозировках — для селективного ингибирования ММП-9 в 1-й опытной группе и сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 во 2-й опытной группе. Препарат вводили внутримышечно 1 раз в день в течение 7 дней.

После 7-дневной терапии ингибитором животных в обеих опытных группах, а также часть животных из контрольной группы, отобранных случайным образом (n=7), вывели из эксперимента путем эвтаназии методом цервикальной дислокации под хлороформным наркозом.

Из оставшихся животных контрольной группы сформировали еще одну опытную группу (n=9) для оценки исследуемых показателей в динамике опухолевого процесса. Этих животных вывели из эксперимента аналогичным образом спустя 28 сут после трансплантации опухолевых клеток.

Оценку динамики увеличения роста первичного опухолевого узла проводили вычислением объема опухолевого узла 1 раз в 3 сут с 5-го дня трансплантации меланомы и вплоть до окончания терапии ингибитором путем измерения длины и ширины узла.

Приблизительный объем опухоли рассчитывали по формуле: длина (в мм) × ширину² (в мм)/2. Сравнение динамики объема опухолевого узла в каждой группе по дням проводили с использованием непараметрического дисперсионного анализа Фридмана. При получении p<0,05 переходили к парным сравнениям для зависимых групп, используя критерий Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Межгрупповые сравнения по каждому дню наблюдения проводили с помощью непараметрического дисперсионного анализа Краскела—Уоллиса, при получении p<0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при p<0,05.

При вскрытии животного извлекали опухолевый узел (рис. 1, а). Часть ткани выделенного опухолевого узла брали для постановки зимографии с целью проверки эффективности ингибирования ММП-9. Для этого образцы ткани меланомы подвергали гомогенизации и получали супернатанты. В супернатантах определяли количество белка по методу Бредфорд и уравнивали пробы по содержанию белка. Далее наносили супернатант в лунку в объеме, содержащем 50 мкг белка, и проводили электрофорез в 6% полиакриламидном геле с 0,1% желатином. Гель отмывали и погружали в раствор инкубационного буфера, инкубировали в термостате при температуре 37 °C в течение 16 ч. Для детекции зон лизиса гель окрашивали при помощи раствора, содержащего 0,01% кумасси G-250, отмывали. Эффективность протеолиза оценивали с помощью гель-документирующей системы ChemiDoc XRS+ («Bio-Rad Laboratories», США) с программным обеспечением Image Lab. Окрашенную зимограмму (см. рис. 1, в) сканировали, на изображении определяли яркость и площадь лизиса. Обработку цифровых данных проводили методом вариационной статистики для двух независимых групп с применением U-теста Манна—Уитни. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при p<0,05.

Для постановки ПЦР в реальном времени небольшой фрагмент опухолевого узла подвергали криоконсервации в жидком азоте. Проводили выделение РНК по стандартному протоколу с помощью системы «Рибо-золь-В» («AmpliSens», Россия). Далее переходили к постановке реакции обратной транскрипции и амплификации, используя наборы для детекции микроРНК TaqMan MicroRNA Assays hsa-miR-21−5p, hsa-let-7b-5p («Applied Biosystems», США). Нормализацию сигнала осуществляли с помощью U6 snRNA («Applied Biosystems», США). Относительные уровни экспрессии онкомикроРНК для исследуемых образцов рассчитывали по формуле: 2^–ΔCT,

где ΔCT = (СТмикроРНК – СТU6snRNA).

При сравнении уровней экспрессии miR-21 и miR-let-7b для исследуемых групп использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела—Уоллиса. При получении p<0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при p<0,05.

Образцы ткани остатков опухолевого узла фиксировали в 10% нейтральном формалине и обрабатывали по общепринятым методикам.

Парафиновые гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Степень выраженности лимфоцитарной инфильтрации определяли путем подсчета среднего числа лимфоцитов в полях зрения опухолевой ткани первичного опухолевого узла для каждого образца. Подсчет в каждом случае проводили в 15 полях зрения при увеличении микроскопа в 200 раз. При сравнении количественных показателей использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела—Уоллиса. При получении p<0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты зимографии подтвердили эффективность ингибирования ММП в исследуемых группах (см. рис. 1, в). В группе животных с ингибированной ММП-9 активность данного фермента статистически значимо ниже, чем в контрольной группе; p=0,01 (см. рис. 1, б).

При оценке объема опухолевых узлов в экспериментальных группах получены статистически значимые различия по каждому дню наблюдения в каждой группе (p<0,05). Однако статистически значимых различий в объеме опухоли на каждый день наблюдения при межгрупповых сравнениях не получено, в том числе после начала терапии ингибитором ММП-9 (см. рис. 1, г).

Отчетливо определялась тенденция к увеличению объема опухолевых узлов в группе, получающей селективное ингибирование ММП-9, по сравнению с показателями в этой группе на начало эксперимента.

Анализ инфильтрации опухолевой ткани лимфоцитами показал статистически значимое увеличение выраженности лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов у мышей с сочетанным ингибированием ММП-9 и ММП-13 по сравнению с контрольной группой, p=0,002 (рис. 2, а, в, г), а также с группой, где ингибировали только ММП-9, p=0,005 (см. рис. 2, а). У животных с селективно ингибированной ММП-9 интенсивность лимфоцитарной инфильтрации не имела статистически значимых различий с контрольной группой (см. рис. 2, а).

При оценке лимфоцитарной инфильтрации в динамике опухолевого процесса получены следующие результаты: выраженность лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов была статистически значимо выше в опытной группе животных, которые были выведены из эксперимента спустя 28 сут после трансплантации меланомы, по сравнению с контрольной группой, животные из которой были умерщвлены через 17 сут после трансплантации; p=0,046 (см. рис. 2, б).

При сравнении уровней экспрессии онкомикроРНК miR-21 в исследуемых группах выявлено, что у животных с сочетанным ингибированием ММП-9 и ММП-13 статистически значимо снижается экспрессия данной онкомикроРНК по сравнению с контрольной группой (р=0,005) и группой животных, у которых ингибировали только ММП-9 (p=0,015). При этом значимых различий по уровню экспрессии miR-21 в группе с селективно ингибированной ММП-9 по сравнению с контрольной группой не получено (рис. 3, а).

Уровень экспрессии другой исследуемой онкомикроРНК miR-let-7b также статистически значимо снижался у животных с сочетанным ингибированием ММП-9 и ММП-13 только по сравнению с контрольной группой (p=0,04), но не различался с группой, где селективно ингибировали ММП-9. В группе с селективно ингибированной ММП-9 уровень экспрессии данной онкомикроРНК не имел статистически значимых различий с уровнем экспрессии в контрольной группе (см. рис. 3, б).

При анализе уровней экспрессии miR-21 и miR-let-7b в группе мышей, умерщвленных на 28-е сутки после трансплантации меланомы по сравнению с контрольной группой, животные из которой умерщвлены на 17-е сутки после трансплантации, статистически значимых различий не выявлено (см. рис. 3, в, г).

Резюмируя вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что ингибирование ММП-9 и ММП-13 не влияет на рост первичных опухолевых узлов.

Селективное ингибирование ММП-9 не оказывает влияния на степень выраженности лимфоцитарной инфильтрации первичного опухолевого узла и не изменяет экспрессию онкомикроРНК miR-21 и miR-let-7b. Cочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 изменяет иммуногенные свойства меланомы, стимулирует инфильтрацию опухолевых узлов лимфоцитами и снижает экспрессию онкомикроРНК miR-21 и miR-let-7b. Степень выраженности лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов в динамике опухолевого процесса возрастает, а уровни экспрессии онкомикроРНК не меняются.

Изменение иммуногенных свойств и стимуляция инфильтрации первичной опухоли лимфоцитами в группе с сочетанным ингибированием ММП-9 и ММП-13 могут быть связаны со снижением активации ERK-киназного пути. Данный механизм передачи сигнала совместно активируется ММП-9 и ММП-13 при некоторых опухолях [13]. ERK-киназный путь регулирует пролиферацию, жизнеспособность и подвижность клеток и является компонентом TGF-β-пути. Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) — мультифункциональный цитокин, впервые идентифицированный при выделении из тромбоцитов [14]. Свое название TGF-β получил благодаря способности стимулировать рост клеток и вызывать их трансформацию in vitro. TGF-β является важным регулятором клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза, иммунного ответа, ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса [14]. TGF-β-путь как один из регуляторов иммунного ответа является основным сигнальным путем, способным сдерживать CD4⁺ T-лимфоциты в состоянии покоя [15]. В реализации данного механизма принимает участие miR-21, ингибирование которой in vivo при системной красной волчанке способствует усилению экспрессии генов, отвечающих за созревание и функциональную активность Т- и NK-клеток [16]. При этом TGF-β обеспечивает конвертацию pri-miR-21 в pre-miR-21 [17].

Полученные нами экспериментальные данные демонстрируют отсутствие влияния селективного ингибирования ММП-9 на миграцию лимфоцитов в опухолевый очаг и уровень экспрессии исследуемых онкомикроРНК. Нельзя исключить, что это связано с компенсаторной активацией других ММП и, в частности, ММП-13, необходимой для совместной активации ERK-киназного пути [13].

Увеличение лимфоцитарной инфильтрации в динамике опухолевого процесса не свидетельствует о смене патофизиологических регуляторных механизмов, а скорее всего объясняется усилением роли неспецифических иммуногенных факторов, попадающих в кровь в ответ на некроз опухоли, а также может объясняться увеличением временнóго периода для полного формирования Т-клеточного иммунитета.

Cочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 снижает экспрессию онкомикроРНК miR-21 и miR-let-7b, что также может быть обусловлено снижением активации TGF-β-пути из-за ингибирования ММП по механизму обратной связи. Это не противоречит опубликованным данным о существовании взаиморегуляторных механизмов между ММП-9, ее активностью и TGF -β. Известно, что TGF-β увеличивает продукцию ММП-9 в клетках различных типов. С другой стороны, и сама ММП-9 также обладает способностью расщеплять неактивный TGF-β, приводя к его активации [18]. TGF-β оказывает положительное влияние на экспрессию ММП, в том числе ММП-9, посредством активации miR-21, обеспечивая конвертацию pri-miR-21 в pre-miR-21. В исследовании, посвященном глиоме головного мозга выявлено, что miR-21 влияет на экспрессию ММП, воздействуя на тканевые ингибиторы ММП [9].

По данным нашего исследования, селективное ингибирование ММП-9 не способствует полному снижению активации TGF-β-пути. Это подтверждается отсутствием статистически значимого снижения miR-21 в группе животных, получивших селективную терапию ингибитором ММП-9. Следовательно, ингибирование ММП-13 как дополнение ингибирования ММП-9 может способствовать угнетению активации TGF-β пути за счет дополнительного снижения активности его компонента — ERK-пути. Это подтверждается статистически значимым снижением экспрессии miR-let-7b при сочетанном ингибировании ММП-9 и ММП-13, поскольку miR-let-7b способна влиять на активацию ERK-пути с помощью таргетинга ингибиторов ММП [12].

Полученные результаты свидетельствуют, что по мере прогрессии опухоли уровень экспрессии онкомикроРНК не изменяется, что указывает на ведущую роль в развитии меланомы других факторов ее микроокружения.

Таким образом, сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 может эффективно изменять в сторону благоприятного исхода для пациента с меланомой кожи важные характеристики биологического поведения опухолевых клеток, что влияет на прогноз и выживаемость при меланоме кожи.

Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 13−04−01381), гранта ККФПН и НТД «Конкурс научно-технического творчества студентов и аспирантов» (доп. соглашение № 11/14 от 19.11.14).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.В.П.

Сбор и обработка материала: Ю.И.Ш., Т.Г. Р., А.К.К.

Анализ и интерпретация данных: А.К.К., Т.Г. Р.

Написание статьи: Н.В.П.

Редактирование: Т.Г. Р.

Конфликт интересов отсутствует.