Рак молочной железы (РМЖ) — наиболее частое злокачественное новообразование у женщин [1]. Развитие карциномы молочной железы можно описать как сложный, многоступенчатый процесс, в котором каждый шаг сопровождается одним или несколькими нарушениями в генах, ответственных за регуляцию клеточного цикла, апоптоз, пролиферацию и дифференцировку. Модель многоступенчатого формирования РМЖ можно условно изобразить следующим образом: норма → гиперплазия → атипичная гиперплазия → карцинома in situ → инвазивная карцинома → метастатический рак [2]. Разумеется, это лишь упрощенная схема. Злокачественная трансформация — динамический процесс с последовательной многоступенчатой эволюцией. На каждом из перечисленных этапов происходит генетическое событие (мутация), придающее клетке-носителю дополнительные селективные преимущества. В результате происходит не только пролиферация клона измененных клеток, но и накопление в них генетических нарушений на каждом новом этапе. Таким образом, генез и прогрессирование опухоли возможны за счет аберрантной функции генов, регулирующих важные аспекты клеточной пролиферации, апоптоза, геномной стабильности, ангиогенеза и метастазирования.

В современной классификации опухолей молочной железы генетическим характеристикам РМЖ уделено большое внимание [3]. Исследования с помощью метода сравнительной геномной гибридизации показали, что на генетическом уровне РМЖ — крайне гетерогенное заболевание [4]. Выявлены корреляции между типом численных генетических нарушений, гистологической стадией и экспрессией эстрогеновых рецепторов как при протоковой карциноме in situ, так и при инвазивной карциноме молочной железы [4, 5]. Стандартное гистологическое исследование с окрашиванием среза опухолевой ткани гематоксилином и эозином является эффективным, экономически обоснованным и надежным способом поставить верный диагноз, а значит провести необходимое лечение [6]. В то же время развитие нашего понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе инициации и прогрессирования опухолевого роста, открывает новые возможности для классификации и лечения РМЖ [7, 8]. Существующие сегодня технологии исследования генома позволяют определять нарушения в сотнях генов. Данные методы были недавно использованы для выявления подтипов и установления разных «профилей» РМЖ [9].

Генетические нарушения, приводящие к онкогенезу, затрагивают два основных типа генов: гены-супрессоры опухолей и онкогены. Гены-супрессоры опухолей (BRCA1, BRCA2, TP53, Rb1, PTEN, CHEK2, CDH1) — это гены, которые препятствуют развитию опухолей, обеспечивают целостность генома, регулируют клеточный цикл, апоптоз, рост и пролиферацию клеток. Нарушение их нормального функционирования в опухолевых клетках происходит вследствие точечных мутаций, метилирования ДНК или физической делеции. В случае онкогенов (HER2/neu, EGFR, CCND1, MDM2, MYC, EMS1), т.е. генов, способствующих развитию опухолей, преобладают другие типы генетических нарушений: транслокации, инверсии, амплификации или точечные мутации. Механизм активации онкогенов различен для лейкозов/лимфом, сарком и карцином. В случае онкогематологических заболеваний активация таких онкогенов, как CCND1 и MYC происходит преимущественно за счет транслокаций.

В опухолях эпителиальной природы эти же онкогены активируются с помощью другого механизма — амплификации, т.е. увеличения числа копий гена на клетку. В связи с тем, что амплификация генов — один из основных механизмов активации онкогенов при РМЖ, изучению именно этой проблемы и посвящена настоящая работа.

Амплификация гена — это многократное увеличение числа его копий в генетическом материале отдельных клеток. Выделяют два основных типа амплификаций: интрахромосомные — в виде гомогенно окрашивающихся регионов ДНК или экстрахромосомные — в виде double minutes [10]. В первом случае дополнительные копии гена расположены на хромосоме последовательно, друг за другом. Double minutes — это мелкие экстрахромосомные кольцевые ДНК, которые содержат дополнительные копии гена, не имеют центромер и теломер. Предполагают, что они способны к самостоятельной репликации. Иногда, например при нейробластомах, число double minutes может быть до нескольких сотен на одну клетку. Обычно (но не всегда) амплификация приводит к гиперэкспрессии гена. Показано, что в 44—62% случаев амплификации генов при РМЖ имеется гиперэкспрессия соответствующих белков [11]. Чаще всего увеличение экспрессии онкогенов приводит к более агрессивному поведению опухоли, ее метастазированию или резистентности к химиотерапии. Однако процесс амплификации обычно затрагивает не отдельный ген, а довольно большой участок генома — ампликон, который может содержать несколько генов, поэтому точное установление гена, придающего опухолевым клеткам дополнительные селективные преимущества, представляется зачастую сложной задачей. Возможно, что измененный характер экспрессии именно нескольких генов, вовлеченных в ампликон, и формирует уникальный фенотип опухоли. Далее приведены хорошо изученные регионы ДНК, содержащие известные онкогены, которые часто подвергаются амплификации при РМЖ [12]:

— 7p12 (EGFR)

— 8q24 (MYC)

— 11q13 (CCND1)

— 12q14 (MDM2)

— 17q12 (HER2)

— 20q12 (AIB1)

— 20q13 (ZNF217)

Рассмотрим наиболее частые из них — MYC, CCND1 и HER2.

Ген MYC локализован в регионе 8q24. Кодируемый им белок играет важную роль в репликации, метаболизме, дифференцировке и апоптозе [13]. Амплификацию MYC обнаруживают в 8—37% РМЖ [12]. Эта мутация в 3 раза чаще наблюдается при медуллярном типе опухоли по сравнению с протоковым и еще реже — при дольковом типе рака [12]. Показаны сложная корреляция между экспрессией и амплификацией MYC, а также связь амплификации MYC с отсутствием в опухоли прогестероновых рецепторов [14].

В работах с использованием методов Саузерн-блот гибридизации и полимерной цепной реакции обнаружена зависимость между амплификацией MYC и высокой гистологической степенью злокачественности, наличием метастазов в лимфатических узлах, отсутствием прогестероновых рецепторов и плохой выживаемостью [15]. При использовании FISH, метода «золотого стандарта» для анализа численных изменений генов, корреляции данного нарушения с клинико-патогистологическими характеристиками были недостоверны. И хотя амплификацию MYC связывают с плохим прогнозом, не ясно, насколько это независимый прогностический маркер при инвазивном РМЖ. При анализе 245 пациентов методом CISH не найдено взаимосвязи амплификации MYC с размером опухоли, гистологическим грейдом, а также экспрессией ER/PR, HER2 и EGFR [21]. Показана связь амплификации MYC с более короткой общей выживаемостью и выживаемостью без метастазов. Вероятно, амплификация MYC может играть важную роль на поздних стадиях опухолевой прогрессии, особенно при активации транскрипционной программы, способствующей развитию метастазов РМЖ [16, 17].

Ген циклина D1 (CCND1) локализован в регионе 11q13 и кодирует белок, контролирующий переход клеточного цикла через G1-фазу. Амплификация гена CCND1 наблюдается в 10—27% всех случаев РМЖ, чаще при дольковом гистологическом типе рака, ассоциирована с экспрессией эстрогеновых/прогестероновых рецепторов в клетках опухоли [12]. Исследования прогностической значимости этой генетической аберрации при РМЖ дают противоречивые результаты. Амплификация гена циклина D1 не обнаруживается у носителей BRCA1 мутаций [18]. Этот факт свидетельствует в пользу различных механизмов онкогенеза в наследственном и спорадическом типах РМЖ. У носителей амплификации CCND1, несмотря на ER(+)-статус, наблюдается резистентность к терапии тамоксифеном. В то же время тамоксифен прекрасно действует на опухоли с ER(+)-статусом, но без амплификации CCND1 [19]. Многие исследователи отмечают важную роль гиперэкспрессии циклина D1 на ранних этапах онкогенеза РМЖ [2, 20]. Амплификация гена CCND1 обычно приводит к гиперэкспрессии данного белка [20]. Однако гиперэкспрессия циклина D1 встречается намного чаще (около 50% РМЖ), чем амплификация этого гена, а значит, кроме амплификации есть и другие механизмы, приводящие к гиперэкспрессии циклина D1 в опухолевых клетках. Наиболее ценный маркер при оценке возможного ответа опухоли на терапию тамоксифеном — амплификация гена CCND1, а не гиперэкспрессия данного белка [19]. Появляются доказательства того, что, кроме регуляции клеточного цикла, циклин D1 способен образовывать прямые комплексы с эстрогеновыми рецепторами и, таким образом, регулировать транскрипционную активность эстрогензависимых генов без участия эстрогена [20]. Следует отметить, что ген CCND1 расположен в регионе 11q13, богатом другими генами. Внутри региона 11q13 находятся как минимум 4 независимо амплифицирующихся участка, и обычно амплификация 11q13 охватывает несколько из них [19]. Амплификация гена CCND1 составляет не менее ²/₃ всех амплификаций 11q13. Тем не менее, до конца не ясно, только ли с геном CCND1 связаны перечисленные клинико-патологические корреляции. Еще один вероятный претендент, находящийся в этом регионе, — онкоген EMS1. Возможно также влияние и других, уже открытых (INT2, FADD, PAK1, EMSY) или пока еще не идентифицированных генов региона 11q13 [21]. Явное вовлечение гена в патогенез опухоли не является гарантией его значимости в качестве прогностического маркера. Важнейшая роль гена CCND1 в патогенезе РМЖ в настоящий момент очевидна, однако его роль как клинико-прогностического маркера еще не вполне изучена [19].

Один из наиболее хорошо изученных генов, участвующих в патогенезе РМЖ, — HER2, расположен в регионе 17q12-21. Этот ген кодирует трансмембранный рецептор с тирозинкиназной активностью — белок из семейства рецепторов эпидермального фактора роста [22]. Амплификация HER2 при РМЖ наблюдается в 10—34% случаев, ассоциирована с высоким грейдом опухоли, отсутствием эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, неблагоприятным прогнозом, короткой выживаемостью пациентов и преимущественно протоковым гистологическим типом опухоли [11, 22]. Амплификация этого гена широко изучена и описана в литературе ввиду его доказанной клинико-диагностической значимости. Его амплификация — это первичный механизм гиперэкспрессии соответствующего протеина на поверхности опухолевых клеток [23]. Белок, в свою очередь, служит мишенью для таргетного препарата — гуманизированного моноклонального антитела (трастузумаб) [24]. Таким образом, амплификация HER2 является прогностическим маркером ответа опухоли на данный препарат. Алгоритм тестирования и оценки HER2-статуса при РМЖ валидирован и стандартизован [23]. В ряде случаев HER2-статус может прогнозировать ответ опухоли и на другие виды системной терапии РМЖ. Положительный HER2-статус опухоли ассоциирован с относительной, но не абсолютной резистентностью к антигормональной терапии и химиотерапевтическим режимам без антрациклинов и таксанов [23]. Напротив, HER2(+)-опухоли хорошо отвечают на терапию антрациклинами, возможно в связи с высокой частотой коамплификации гена топоизомеразы-IIα (TOP2α) в опухолях с амплификацией HER2.

В одной из работ изучены частота и клиническая значимость амплификаций 11 генов (MED1, STARD3, HER2, GRB7, THRA, RARA, TOP2A, IGFBP4, CCR7, KRT20, KRT19 и GAS), расположенных в регионе 17q12-q21, т.е. в непосредственной близости к гену HER2 [25]. Оказалось, что амплификации этих генов наблюдались только при амплификации гена HER2. Причем частота встречаемости амплификации каждого из этих генов уменьшалась по мере увеличения дистанции от гена HER2. Амплификация HER2, по-видимому, способствует генетической нестабильности на участке 17q, что приводит к различному спектру амплификаций находящихся в этом регионе генов.

Кроме перечисленных, при РМЖ также описаны амплификации генов FGFR1, S6K, TOP2α, EMS1, FGF3, AKT2, PIP4K2, PRDM14, ADAMS, EMSY, IKBKB, AURKA, ESR1, CCNE [12, 26, 27]. Некоторые из этих нарушений имеют установленную клиническую значимость. Также при РМЖ амплификация может наблюдаться в следующих регионах ДНК — 1p, 1q, 3q, 4q, 6p, 6q, 8p, 10p, 14q, 15q, 16p и 19q. Однако конкретный ген, находящийся внутри этих ампликонов, пока не установлен. Таким образом, количественные нарушения ДНК при РМЖ встречаются часто и могут определять основные патогенетические события [28]. При этом число таких нарушений зависит от степени «продвинутости» онкогенеза. Их количество крайне мало при гиперплазии и резко увеличивается в карциноме in situ [29]. Стабилизация спектра генетических нарушений происходит на более поздних стадиях онкогенеза.

Кроме того, что амплификация приводит к изменению экспрессии генов, она также является индикатором геномной нестабильности. Геномная нестабильность — это нарушение функции генов, вовлеченных в регуляцию митоза и репарацию ДНК. В этих условиях целостность генома находится под угрозой, поскольку происходящие нарушения ДНК не устраняются системами репарации. Увеличение геномной нестабильности приводит к росту риска развития новых генетических изменений, которые, в свою очередь, могут дать опухоли дополнительные селективные преимущества, необходимые для прогрессирования, способности к метастазированию, экспрессии факторов роста и индукции ангиогенеза. В этом случае амплификация гена может иметь прогностическую значимость в качестве индикатора плохого прогноза [12]. Это особенно применимо к опухолям, несущим несколько амплификаций. Показано ступенчатое ухудшение выживаемости у пациентов с увеличением числа амплификаций на опухолевую клетку [12]. В этой же работе проведен анализ частот встречаемости амплификаций каждого из 5 исследованных генов (HER2/neu, MYC, CCND1, MDM2, EGFR). Далее была рассчитана вероятность развития соответствующих коамплификаций. Выяснилось, что фактические частоты выявленных коамплификаций были, как минимум, несколько выше расчетных, т.е. опухоли, достаточно генетически нестабильные для развития одной амплификации, имеют повышенный риск развития множественных амплификаций. Более 40% опухолей с амплификацией HER2 и более 50% опухолей с амплификацией MYC, CCND1, MDM2 или EGFR имеют в составе генома более одного амплифицированного гена [12].

Несколько работ посвящено исследованию роли амплификаций генов в возникновении, прогрессировании, инвазии и метастазировании РМЖ [1, 26, 30]. В частности, сравнивали число и спектр амплификаций генов в клетках карциномы in situ c клетками инвазивного компонента опухоли у того же пациента. Оказалось, что частота амплификаций генов HER2/neu, ESR1, MYC, CCND1 примерно одинакова для обоих компонентов [26]. Аналогичная ситуация имела место и при метастазах опухоли в лимфатических узлах по сравнению с первичной опухолью. Авторами сделан вывод о том, что амплификации данных генов — это ранние патогенетические события, которые играют важную роль в развитии опухоли, но не в инициации инвазивного роста. К таким выводам пришли и другие исследователи [30], проанализировавшие численные нарушения в 21 гене (ESR1, EGFR , FGFR1, ADAM9, IKBKB, PRDM14, MTDH, MYC, CCND1, EMSY, CDH1, TRAF4, CPD, MED1, HER2, CDC6, TOP2A, MAPT, BIRC5, CCNE1, AURKA) на материале, полученном при лазерной микродиссекции инвазивного и in situ компонентов РМЖ у одних и тех же пациентов. Генетический статус в обоих случаях отличался незначительно. В этой связи можно сделать вывод о том, что протоковая карцинома in situ с генетической точки зрения настолько же «развита», как и инвазивный компонент опухоли. Большинство генетических нарушений, обнаруживаемых при РМЖ, можно найти уже на стадии протоковой карциномы in situ [30]. Известно, что чем больше развита опухоль, тем значительнее перестроен ее геном. С помощью метода мультиплексной лигазозависимой амплификации зондов (MLPA) в одной опухоли находили до 5 амплификаций генов [27]. Как уже отмечалось, наличие нескольких амплификаций может являться индикатором плохого прогноза или худшей выживаемости. Однако не ясно, с чем именно это связано: собственно с числом амплифицированных генов или с тем, какие именно гены подверглись амплификации.

РМЖ — крайне гетерогенное заболевание, и эта гетерогенность может быть напрямую связана с вариабельностью на генетическом уровне. Ввиду этого изучение нарушений ДНК при РМЖ, их классификация и систематизация могут помочь распознавать отдельные подтипы данного заболевания. В свою очередь, это открывает новые возможности для понимания и прогнозирования поведения данных опухолей, а значит и путей их лечения. Несмотря на достигнутый успех в генетических исследованиях РМЖ, ни один из исследуемых генов изолированно не может дать прогноз поведения опухоли или ее ответа на терапию.

В этой связи необходимо исследование большой выборки пациентов с помощью метода, позволяющего одновременно анализировать многие гены. Это позволит составить более полный «генетический профиль» РМЖ, и, возможно, обнаружить новые корреляции между генетическими, гистологическими, клиническими и эпидемиологическими данными. С этой целью многообещающим представляется метод MLPA, который позволяет одновременно анализировать численные нарушения десятков генов [27, 31].

Тактика ведения больных РМЖ основана на классических клинико-патологических маркерах (размер опухоли, степень поражения лимфатических узлов, наличие отдаленных метастазов и рецепторов к стероидным гормонам).

До настоящего времени использование генетических нарушений в качестве прогностических маркеров не имело большого значения, в том числе ввиду отсутствия альтернативных способов лечения для различных подтипов заболевания. С появлением таргетных препаратов возрос интерес к выявлению отдельных подтипов опухолей. Наряду с размером, типом, распространенностью, стадией и другими клинико-патологическими признаками, генетические маркеры опухоли становятся ее неотъемлемыми характеристиками. ДНК намного стабильнее РНК и белков, что делает ее удобным и надежным объектом для диагностических исследований. Количество новых генов, в которых обнаруживаются различные нарушения при РМЖ, из года в год увеличивается.

В настоящее время необходимо проводить параллельный патогистологический и генетический анализ пациентов РМЖ, чтобы в будущем с помощью «генетического профиля» можно было прогнозировать поведение опухоли, а также выделять фенотипические подгруппы данного заболевания.