В последние годы в развитых странах возросла частота встречаемости оппортунистических вирусных инфекций, что связывают в первую очередь с активным применением иммуносупрессивной терапии, сопутствующей трансплантации различных органов, в том числе трансплантации почек. По данным серологических исследований от 50% (аденовирусы) до 90% (полиомавирус, герпесвирусы) населения имеют антитела к оппортунистическим вирусам, инфицирование происходит еще в детском возрасте, после чего заболевание в большинстве случаев протекает у иммунокомпетентных пациентов бессимптомно или вызывает легкие инфекции, приобретающие затем латентное течение. Однако для иммунокомпрометированных лиц они представляют серьезную опасность, особенно когда речь идет о детской популяции [1—3].

Аденовирусы — семейство двухцепочечных безоболочечных литических ДНК-содержащих вирусов, подразделяющихся на 6 групп и более чем на 50 серотипов. Аденовирусная инфекция в почечном трансплантате встречается довольно часто, особенно в первые месяцы после трансплантации [1, 4—8]. Стоит отметить, что аденовирусы имеют механизмы уклонения от иммунного ответа, такие как ингибиция функции интерферонов с помощью вирусассоциированной РНК и гена E1A, ингибиция внутриклеточного апоптоза в инфицированных клетках и предотвращение экспрессии антигенов большого комплекса гистосовместимости класса 1 на клеточной поверхности [1].

Полиомавирус — распространенный вирус семейства Papovaviridae, доля серопозитивных лиц в общей популяции достигает 60—100%. Первичное инфицирование обычно происходит в детском возрасте, также подтверждена возможность переноса вируса с донорским органом. Полиомавирусы способны приводить к полиомавирусной нефропатии трансплантата (PVN), чаще всего вызванной двумя штаммами вируса: BK-вирусом и реже JC-вирусом [6].

Герпесвирусы — семейство ДНК-содержащих вирусов, включающее α-герпесвирусы (HSV-1, HSV-2), β-герпесвирусы (цитомегаловирус) и γ-герпесвирусы (вирус Эпштейна—Барр).

Распространенность HSV очень высока — инфекция поражает до 95% людей во всем мире. Как и все герпесвирусы, после первичного инфицирования HSV способен латентно персистировать в организме, возобновляя продуцирование вирусных частиц при снижении иммунитета. Первичная HSV-инфекция редко встречается у реципиентов почечного трансплантата. Наиболее часто отмечается реактивация вируса, не сопровождающаяся развитием клинической симптоматики, встречается информация о возможности диссеминации возбудителя с вовлечением внутренних органов, однако подобные случаи чрезвычайно редки [1].

Цитомегаловирус (CMV) — двухцепочечный ДНК-содержащий вирус, после первичной инфекции латентно персистирующий в миелоидных клетках-предшественниках. Частота вирусоносительства в странах Восточной Европы более 80—85% [6]. У пациентов с трансплантированными органами выделяют CMV-инфекцию — репликацию вируса без клинических симптомов и CMV-болезнь — репликацию CMV в сочетании с симптомами заболевания. CMV-инфекция занимает ведущее место среди вирусных инфекций у пациентов после пересадки органов как по частоте, встречаясь у 30—80% пациентов, так и по тяжести проявлений. Максимальный риск развития СМV-инфекции приходится на первые полгода после трансплантации с пиком заболеваемости между 2-м и 3-м месяцем. Основными факторами риска CMV-болезни для реципиентов трансплантата являются: трансплантация органа от серопозитивного донора к серонегативному реципиенту, усиление режима иммуносупрессии, а также применение препаратов антилимфоцитарных антител [6, 9, 10].

Вирус обладает иммуномодулирующими свойствами. Репликация CMV индуцирует иммуносупрессивное состояние за счет функциональных изменений в лимфоцитах и моноцитах. CMV-инфекция также связана с активацией других герпесвирусов, таких как HSV, вирус Варицелла—Зостер, Эпштейна—Барр или вирусы герпеса человека (HHV 6, 7, 8) [9].

Вирус Эпштейна–Барр (EBV) — двухцепочечный ДНК-содержащий вирус, существующий в клетках в латентной или литической фазе. EBV может инфицировать В- и Т-лимфоциты, эпителиальные, гладкомышечные и фолликулярные дендритные клетки. Вирусный геном сохраняется в небольшой части В-лимфоцитов в течение всей жизни. Поскольку 90% взрослого населения имеют антитела к EBV, симптоматическая инфекция наиболее часто встречается у нативных по данному вирусу детей. EBV связан с развитием посттрансплантационного лимфопролиферативного заболевания (ПТЛЗ) и широким спектром злокачественных новообразований [6, 11—13].

Почти все реципиенты инфицированы или в итоге станут инфицированы EBV, но только у некоторых из них разовьется ПТЛЗ. Среди факторов риска ПТЛЗ выделяют EBV-серонегативность или активную первичную EBV-инфекцию на момент трансплантации, спленэктомию в анамнезе, повторную трансплантацию, пожилой и детский возраст, сочетание с CMV и другими вирусными инфекциями, реакцию трансплантат против хозяина, режим иммуносупрессии и др. [6, 12].

Активации вирусов после трансплантации способствуют многочисленные факторы, такие как иммуносупрессия (особенно снижение цитотоксического иммунитета), последствия лечения отторжения трансплантата и сочетанная репликация вирусов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Кроме того, реакция реципиента менее эффективна из-за несоответствия основных антигенов гистосовместимости, что снижает эффективность прямого пути противовирусного клеточного иммунного ответа и повышает восприимчивость к вирусным инфекциям. Вирусная инфекция может быть первичной, реактивацией персистирующего вируса, а также передаваться реципиенту через донорский орган. При трансплантации почек риск развития тяжелых жизнеугрожающих осложнений и потери трансплантата наиболее высок в первые месяцы после трансплантации, в период подбора иммуносупрессивной терапии [1, 2, 4—6].

Актуальность изучения вирусных инфекций трансплантата обусловлена не только повсеместным распространением оппортунистических инфекций, но и способностью многих вирусов, например аденовирусов и CMV, оказывать модулирующее действие на иммунный ответ хозяина, способствуя персистенции вируса либо провоцируя реакцию отторжения [1]. Отношения между вирусными инфекциями и развитием отторжения аллотрансплантата остаются спорными, однако имеются данные о прямой и косвенной связи этих процессов [4]. Учитывая нередкое отсутствие характерной морфологической картины вирусного поражения и возможность сочетанного течения инфекций, представляется важным комплексный клинико-морфологический подход к оценке диагностических биоптатов трансплантатов [1].

Цель настоящего исследования — сопоставление картины морфологических изменений и результатов определения ряда вирусов в биоптатах с клиническими проявлениями у реципиентов почечных трансплантатов.

Клинико-морфологическое исследование проведено на диагностическом материале 71 пункционной биопсии почечных трансплантатов, полученных от 61 пациента (от 2 до 63 лет, медиана возраста 20 лет), проходивших лечение в РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского в период с 2004 по 2016 г. В качестве контрольной группы использовались биоптаты 10 собственных почек, которые были получены при нефрэктомии.

Материал пункционных биопсий фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,4), осуществляли проводку на гистопроцессоре и заливали в парафин. Для гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) исследования изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм. Для гистологического исследования биоптатов почечных трансплантатов использовали окраску гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, PAS-реакцию. Депарафинирование и ИГХ-исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica») c первичными мышиными моноклональными антителами к аденовирусу («Abcam», клон М58+М73; разведение 1:100), цитомегаловирусу рр56 («Abcam», клон 2+6; разведение 1:400), ядерному антигену вируса Эпштейна—Барр («Abcam», клон Е1−2.5; разведение 1:3000), вирусу герпеса I типа («Сell Marque», клон 10А3; разведение 1:800) и поликлональными кроличьими антителами к вирусу герпеса II типа («Сell Marque», поликлональные; разведение 1:600).

Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Оценку морфологической картины проводили в соответствии с критериями Banff-классификации. Экспрессию вирусных частиц определяли в цитоплазме клеток и оценивали полуколичественным методом: +++ — выраженная, ++ — умеренная, + — слабая, (–) и (+/–) — отрицательная и незначительная экспрессия. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру (Leica СTR 5000).

Проводили сопоставление клинических данных, таких как наличие вирусов в моче (полиомавирус) и крови (полиомавирус, цитомегаловирус, вирус Эпштейна—Барр), уровень креатинина, протеинурия, значения АД, заключения УЗИ, родственный и трупный тип трансплантата, пол и возраст пациентов, с морфологической и ИГХ-картиной.

Для статистической обработки данных применяли метод Пирсона χ², точный метод Фишера. Статистическую значимость принимали при p<0,05.

По результатам морфологического и ИГХ-исследования вирусный нефрит наблюдался в 37 (52,1%) случаях, острое отторжение и пограничные изменения в трансплантате — в 12 (16,9%), сочетание пограничных изменений с вирусным нефритом — в 15 (21,1%), вирусные частицы без морфологических признаков нефрита — в 7 (9,9%) случаях. В 52 (73,2%) случаях выявлена экспрессия антигенов аденовируса, в 40 (56,3%) случаях — вируса герпеса I типа, в 1 (1,4%) случае — цитомегаловируса, экспрессия вируса герпеса II типа в 8 (11,2%) случаях была оценена как незначительная (табл. 1).

Достоверно чаще морфологические проявления нефрита отмечались у пациентов с выявлением аденовирусных антигенов ИГХ-методом (p<0,05) (рис. 1, а, б, табл. 2). Выраженная экспрессия аденовируса наблюдалась у 4 пациентов, умеренная — у 24, слабая — также у 24, незначительная — у 13 пациентов, у 6 человек экспрессия отсутствовала. При сравнении исследуемой группы с группой контроля экспрессия антигенов аденовируса достоверно чаще (p<0,05) выявлялась у пациентов после трансплантации, что подтверждает влияние иммуносупрессивной терапии на активацию аденовирусной инфекции (табл. 3).

При морфологическом исследовании основными признаками аденовирусного нефрита являлись наличие внутриядерных включений вирусных телец; повреждение эпителия канальцев с разрушением базальных мембран и фокусами некроза; мононуклеарная и плазмоцитарная клеточная инфильтрация в отдельных случаях с формированием гранулем; фокальные интерстициальные кровоизлияния и внутриканальцевые скопления эритроцитов (см. рис. 1, в, г).

Особенностью аденовирусного нефрита, затрудняющей морфологическую и ИГХ-диагностику, являются очаговый характер вирусного поражения паренхимы, а также большое количество серотипов аденовирусов (более 50) [1, 5, 6, 8], которое может приводить к ложноотрицательным результатам при ИГХ-диагностике: в нашем исследовании у 3 пациентов с характерной морфологической картиной аденовирусного нефрита антитела выявлены не были.

У пациентов с иммуносупрессией по сравнению с иммунокомпетентными лицами отмечается более пролонгированная, тяжелая, иногда приводящая к летальным последствиям аденовирусная инфекция. Наиболее тяжелое течение аденовирусной инфекции чаще наблюдается в раннем посттрансплантационном периоде, сопровождающемся интенсивной иммуносупрессивной терапией [5], преимущественно у детей до 5 лет (по некоторым данным, до 9), что в первую очередь связывают с возможностью первичного инфицирования и несформированностью детского иммунитета [1, 3, 4, 8]. Результаты нашего исследования подтвердили связь возраста пациентов и сроков после трансплантации почки с тяжестью вирусного поражения: из 37 случаев вирусного нефрита потеря трансплантата отмечалась у 4 детей от 2 до 6 лет и 1 взрослого пациента, причем у детей потеря трансплантата наступала в первые месяцы после операции (p<0,05) (табл. 4, 5), что согласуется с данными многочисленных исследований [1, 3, 4, 8, 14—16].

При УЗИ, предшествовавшем потере трансплантатов у пациентов с вирусным нефритом, у 4 из 5 пациентов отмечались выраженные изменения: утолщение коркового слоя, у некоторых с увеличением толщины трансплантата; снижение пиковой систолической скорости на уровне всех почечных сосудов, диастолический кровоток был значительно снижен или отсутствовал вплоть до отрицательной диастолы. У 1 из пациентов ультразвуковая картина более всего соответствовала острому отторжению. УЗИ наглядно демонстрирует патологические изменения трансплантата, однако специфических эхо- и допплерографических признаков поражения трансплантата вирусом выявить не позволяет.

Дифференциальная диагностика аденовирусного нефрита проводилась с прочими типами вирусных инфекций, в первую очередь с полиомавирусной нефропатией (PVN), которым не свойственны преобладание таких изменений, как деструкция канальцев с формированием фокусов некроза и разрушением базальных мембран, гранулематозное воспаление с палисадным расположением макрофагов вокруг пораженных канальцев и кровоизлияния в интерстиций [5—7].

Хотя пункционная биопсия трансплантата является золотым стандартом диагностики PVN, выявляя специфическую морфологическую картину при типичном течении инфекции, на ранних стадиях заболевания постановка диагноза при гистологическом исследовании может представлять сложность [6, 17—20]. Для уточнения диагноза в нашем исследовании использовался метод ПЦР, с помощью которого ВК-вирус был выявлен у 10 пациентов: характерная морфологическая картина PVN с очагами некроза канальцевого эпителия, наличием внутриядерных аморфных базофильных включений матово-стекловидных телец (рис. 2, а, б), интерстициальным воспалением и склерозом коркового и мозгового слоев наблюдалась в 4 биоптатах от 3 из этих пациентов, что согласуется с высокой чувствительностью ПЦР, позволяющей определять слабую репликацию вируса, еще не сопровождающуюся гистологическими изменениями [11]. Также отсутствие специфических признаков PVN у этих пациентов может объясняться возможностью очагового поражения паренхимы.

ПЦР также является ведущим методом мониторинга, проводимого у реципиентов трансплантата для предотвращения развития CMV-болезни. Выявление репликации CMV методом ПЦР не обязательно сопровождается морфологическими изменениями — благодаря своевременной диагностике и профилактике значительно чаще встречается бессимптомная CMV-инфекция [9]. В данном исследовании при ПЦР наличие ДНК CMV выявлено у 9 пациентов, у 1 из них отмечена иммуногистохимическая картина CMV-нефрита, сочетавшаяся с неспецифическими морфологическими проявлениями нефрита. Цитопатические изменения с внутриядерными, так называемый глаз совы, и цитоплазматическими включениями в клетках эпителия канальцев и эндотелия сосудов у данного пациента не наблюдались.

Определение ДНК вируса EBV в настоящее время входит в рутинную медицинскую практику с целью своевременной диагностики и прогнозирования развития ПТЛЗ у реципиентов трансплантата. В то время как у многих здоровых реципиентов трансплантата выявляется низкий уровень вирусной нагрузки, высокая вирусная нагрузка EBV тесно связана с текущим или вероятным развитием ПТЛЗ. Диагноз ПТЛЗ при биопсии трансплантата достаточно сложен, в связи с чем актуально использование таких методов, как ПЦР и ИГХ [6, 11, 12, 21]. В текущем исследовании морфологических признаков EBV отмечено не было, при ИГХ-исследовании в 100% случаев наблюдалось наличие ядерного антигена вируса Эпштейна—Барр, что подтверждает широкое распространение латентно персистирующего вируса, при ПЦР ДНК вируса EBV с низкой вирусной нагрузкой была выявлена у 5 пациентов.

Трактовку роли герпесвирусов в развитии нефрита осложняло сочетанное выявление антител к аденовирусам у большинства пациентов с HSV-инфекцией. При ИГХ-исследовании экспрессия антител к HSV-1 от слабой до значительной обнаружена в 40 (56,3%) биоптатах, в 8 (11,2%) биоптатах определялась незначительная экспрессия HSV-2, однако достоверная связь выявления HSV-1 и HSV-2 с развитием морфологических изменений установлена не была (p>0,05).

Протеинурия и повышение уровня креатинина выявлены как у пациентов с вирусным нефритом (в 13 и 32 случаях соответственно), так и без него (в 3 и 9 случаях), причем в обеих группах встречались пациенты с реакцией отторжения и хронической трансплантационной гломерулопатией, что не позволило отнести подобные изменения к специфичным для вирусного поражения трансплантата и говорить о наличии достоверной связи (p>0,05).

Родственный либо трупный тип трансплантата не повлиял на развитие нефрита и частоту потери трансплантата (p>0,05). Не была также обнаружена связь пола пациентов с развитием вирусного нефрита (p>0,05). Оценка значений артериального давления оказалась малоинформативной в связи с назначением пациентам гипотензивных препаратов.

В нашем исследовании экспрессия антигенов аденовируса чаще выявлялась у пациентов с посттрансплантационным нефритом, чем у реципиентов без нефрита или в контрольной группе, что подтвердило актуальность применения ИГХ-метода для выявления вирусного нефрита. Отмечен риск тяжелого течения вирусного нефрита с возможностью потери трансплантата у пациентов младшего возраста в ранние (первые месяцы) сроки после трансплантации. Потере трансплантата предшествовали выявленные при УЗИ изменения гемодинамических показателей и утолщение коркового слоя. ПЦР подтвердила наличие полиомавируса у пациентов с морфологической картиной полиомавирусной нефропатии. Таким образом, учитывая разнообразие факторов, влияющих на течение инфекции в почечном трансплантате, при подозрении на вирусный нефрит целесообразно сочетать морфологическое исследование с иммуногистохимическим и оценкой клинических данных.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.М.К., Е.М.П.

Сбор и обработка материала: С.Е.С., Е.М.П., М.М.М., Н.А.К., А.В.М.

Статистическая обработка: С.Е.С.

Написание статьи: С.Е.С., Е.М.П.

Редактирование: Е.М.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.