В последние 10 лет достигнут большой прогресс в области понимания биологических механизмов канцерогенеза при раке молочной железы (РМЖ). Описание С. Perou [15] молекулярно-генетических подтипов РМЖ позволило добавить к «классическим» факторам прогноза (возраст, размер опухоли, стадия заболевания, количество лимфатических узлов с метастазами) параметры генной экспрессии. Это приблизило клиницистов к возможности индивидуализации схем терапии РМЖ. Впоследствии в работах Т. Sorlie и C. Cheang была предложена суррогатная молекулярно-генетическая классификация РМЖ на основе иммуногистохимического определения четырех различных маркеров — рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PgR), HER2/neu и пролиферативной активности на основании экспрессии белка Ki-67 [5]. В том виде, в каком она была одобрена экспертами на 12-й Международной Сент-Галленской конференции в 2011 г., эта классификация выглядит следующим образом [9]:

1. Люминальный А — ER(+) и/или PgR(+), HER2/neu(–), Ki-67 <14%.

2. Люминальный В — ER(+) и/или PgR(+), HER2/neu(–), Ki-67 >14% либо HER2/neu(+).

3. HER2-положительный — ER(–), PgR(–), HER2/neu(+).

4. Тройной негативный — ER(–), PgR(–), HER2/neu(–).

Все четыре подтипа РМЖ характеризуются совершенно различной биологией, прогнозом и требуют особых терапевтических подходов. Самым прогностически благоприятным является люминальный А подтип РМЖ, к которому относятся 60—65% от общего количества больных. Прогноз в отношении люминальных В опухолей является менее благоприятным и одновременно менее определенным. Это обусловлено гетерогенностью опухолей, составляющих данный подтип. Только 30% случаев люминальных В опухолей являются HER2(+), еще 70% имеют формальные признаки люминального А варианта [ER/PgR(+); HER2/neu(–)], но при этом отличаются от него высоким индексом пролиферации (Ki-67 >14%). По-видимому, нельзя считать эти два параметра (HER2/neu и Ki-67) в полной мере определяющими прогноз люминальных В опухолей. Представляется целесообразным поиск дополнительных молекулярных маркеров, уточняющих прогноз течения заболевания рецидива и у больных РМЖ HER2-положительного подтипа. В особенности же это необходимо для тройных негативных РМЖ, наиболее агрессивной группы опухолей с отсутствием экспрессии белков, определяющих прогноз в остальных молекулярно-генетических подтипах.

Одним из кандидатов на роль дополнительного прогностического фактора при РМЖ является антиапоптотический белок Bcl-2. Основным механизмом его действия считается инактивация проапоптотических гомологов семейства Bcl-2 путем димеризации с ними и, как следствие, подавление выхода из митохондрий цитохрома С, необходимого для активации каспаз [2]. Однако анализ клинических данных свидетельствует, что повышенная экспрессия Всl-2 при РМЖ коррелирует с низким уровнем пролиферации, наличием в опухоли ER и с благоприятным прогнозом в целом [4, 7, 14]. Этот парадоксальный факт объясняли положительной ER-зависимой регуляцией экспрессии Bcl-2 [4]. Получены данные, свидетельствующие о том, что ER(+) РМЖ с отсутствием экспрессии Bcl-2 имеют худший прогноз по сравнению с ER(–) опухолями, клетки которых экспрессируют Bcl-2 [7]. Поэтому, несмотря на то что некоторые тесты, определяющие прогноз для ER(+) пациентов, основаны в том числе на определении уровня мРНК Bcl-2 в опухоли (тест Oncotype DX), оценка уровня экспрессии белка Bcl-2 может предоставить дополнительную информацию для прогноза и ER(–) РМЖ.

Материалом для исследования служили 290 образцов операционного материала инвазивного протокового РМЖ, отобранных из архивов ГБУ РО «ПАБ» и ГБУЗ «ПКПБ» за 2010—2011 гг. Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования использовали ready-to-use FLEX антитела к рецепторам эстрогена (ER, клон 1D5), прогестерона (PR, клон PgR636), маркеру пролиферативной активности Ki-67 (клон MIB1) и белку Bcl-2 (клон 124), а также концентрированное поликлональное кроличье антитело к HER2/neu (разведение 1:500). Депарафинирование и демаскировку антигенов во всех случаях, за исключением HER2/neu-тестирования, проводили в модуле предварительной подготовки PT-Link. ИГХ-окрашивание выполняли на автоматическом иммуногистостейнере Dako с использованием системы визуализации EnVision FLEX. Результаты ИГХ-реакции с антителами к ER и PR интерпретировали путем подсчета количества окрашенных ядер опухолевых клеток. При этом, согласно рекомендациям ASCO/CAP, положительными считались такие опухоли, окрашивание в которых наблюдалось хотя бы в 1% клеток. Результаты реакций с анти-Ki-67 антителами оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения и выражая полученные результаты в процентах. Экспрессию Bcl-2 расценивали как положительную при цитоплазматическом окрашивании более 10% опухолевых клеток [4].

При выполнении HER2/neu-тестирования демаскировку антигенов проводили 40-минутной инкубацией в термостатированной водяной бане при 95 °С с использованием цитратного буфера (pH 6,0). Саму процедуру ИГХ-окрашивания осуществляли на автоматическом иммуногистостейнере Dako с использованием системы визуализации EnVision для кроличьих антител. При оценке реакции с антителами к HER2/neu использовали общепринятую для фармакодиагностики шкалу оценки от 0 до 3+ [1]. FISH-исследование проводили по стандартной методике к набору HER2 FISH pharm DxTM Kit («Dako»). Для денатурации при 82 °С в течение 5 мин и гибридизации (45 °С, 20 ч) применяли автоматический гибридайзер («Dako»). Амплификацию оценивали с помощью флюоресцентного микроскопа Leica DM RXA при ×100. Оценку наличия/отсутствия амплификации проводили, подсчитывая соотношение красных и зеленых меток (соответствующих меченым участкам гена HER2/neu и CEP17) в 20 ядрах. При соотношении красных к зеленым меткам более 2,2 результат считали положительным.

При статистической обработке полученных результатов для оценки достоверности различий между группами использовали критерий χ². Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Отобранные по иммунофенотипу и данным FISH-исследования 290 случаев инвазивного протокового РМЖ были разделены на четыре молекулярно-генетические подгруппы. Люминальные А опухоли составили 48,5%, люминальные В — 28,5%, HER2(+) — 8,6% и тройные негативные РМЖ — 14,4%. Все люминальные А РМЖ экспрессировали Bcl-2, причем интенсивность окрашивания колебалась от умеренной до интенсивной и наблюдалась в подавляющем большинстве опухолевых клеток (см. рисунок а, б).

В люминальных В опухолях, так же являющихся ER(+), как и люминальные А, экспрессия Bcl-2 обнаруживалась только в 77% случаев, что свидетельствует о существовании в опухолевых клетках наряду с ER-зависимой регуляцией уровня Bcl-2 и других механизмов. Интересно, что в подавляющем большинстве люминальных В опухолей экспрессия Bcl-2 была очаговой, а интенсивность окрашивания колебалась от слабой до умеренно выраженной (см. рисунок в, г). Люминальные В опухоли, не экспрессирующие Bcl-2, имели достоверно более высокий уровень пролиферативной активности по сравнению с Bcl-2-положительными (p<0,05), что подтверждает возможность существования у белка Bcl-2 дуалистических функций — не только антиапоптотической, но и антипролиферативной. И если в гемопоэтических опухолях, таких как лимфома зоны мантии или хронический лимфолейкоз, Bcl-2 выступает как ингибитор апоптоза, то в клетках РМЖ более выражен антипролиферативный эффект Bcl-2.

Это предположение подтверждается нашими наблюдениями, свидетельствующими о значительном снижении экспрессии Bcl-2 в прогностически неблагоприятных HER2/neu(+) и тройных негативных РМЖ. Только 14% случаев, отнесенных к данным подтипам, являлись Bcl-2-положительными.

Недавно было показано, что HER2/neu(+) и тройные негативные РМЖ с наличием экспрессии Bcl-2, являющиеся ER(–), обладают лучшим прогнозом по сравнению с эстрогенпозитивными люминальными опухолями, в которых экспрессии Bcl-2 не обнаруживается [10]. Более того, белок Bcl-2 может являться не только важным прогностическим, но и предсказательным фактором в HER2/neu(+) и тройных негативных РМЖ. Показано, что имеется прямая корреляционная связь между уровнем экспрессии Bcl-2 и резистентностью опухоли к химиотерапии и терапии трастузумабом [3, 6]. Данный факт свидетельствует о необходимости включения Bcl-2 в стандартную иммуногистохимическую панель тестирования РМЖ.

Замечено, что в дополнение к антиапоптотическим и антипролиферативным свойствам Bcl-2 оказывает влияние на генетическую стабильность в опухолях. Так, показано, что этот белок ингибирует репарацию двунитевых разрывов ДНК [11, 12]. Мы попытались оценить взаимосвязь Bcl-2 с другими генетическими аберрациями — амплификацией гена HER2/neu и центромерного региона хромосомы 17. Они могут быть выявлены при определении статуса HER2/neu в опухоли с помощью FISH. Принято считать, что, если количество центромерных сигналов в опухоли отличается от стандартных двух сигналов на ядро, это свидетельствует об анеуплоидии, чаще всего — полисомии хромосомы 17, хотя в последнее время появились сообщения, опровергающие данное положение [13, 18]. Так, I. Yeh и соавт. [18] с помощью полногеномного анализа показали, что полисомия хромосомы 17 — очень редкое явление при РМЖ, гораздо чаще наблюдается амплификация ее центромерного региона. В связи с этим мы не пользуемся термином «полисомия» в отношении наблюдающегося при РМЖ увеличения количества CEP17.

FISH-исследование было проведено на образцах опухолевой ткани 92 пациентов — случайным образом отобранных из всех молекулярно-генетических подгрупп в соответствии с их долями в выборке (45 люминальных А, 26 люминальных В, 8 HER2(+) и 13 тройных негативных РМЖ). Анализ полученных данных показал, что в Bcl-2(+) РМЖ очень редко (в 2,4% случаев) наблюдаются такие генетические аберрации, как амплификация HER2/neu в сочетании с увеличением CEP17 до 3 и более в одном ядре. Сравнительно редко (в 7,2 и 5,3% случаев) наблюдаются увеличение количества CEP17 и амплификация HER2/neu соответственно. Вместе с тем в опухолях с отсутствием экспрессии Bcl-2 сочетанные аберрации (как в центромерном регионе хромосомы 17, так и в гене HER2/neu) выявляются в 28% исследованных образцов (см. рисунок, д), а общее количество случаев с тем или иным генетическим нарушением достигает 65%.

Если представить данные FISH-исследования в виде четырехпольной таблицы, вычисленному значению критерия χ², равному 21,7227, будет отвечать уровень значимости р=0,0005 (см. таблицу).

Таким образом, наши данные расходятся с имеющимися в литературе сведениями о сочетании экспрессии Bcl-2 с формированием генетически нестабильной популяции опухолевых клеток. Это требует дальнейшего изучения той роли, которую играет Bcl-2 в инициации и прогрессии различных молекулярно-генетических подгрупп РМЖ. Несомненно также, что Bcl-2, являясь центральной фигурой множества регуляторных систем клетки, таких как апоптоз, пролиферация и поддержание генетической стабильности в опухоли, заслуживает пристального внимания как возможный дополнительный прогностический и предсказательный фактор при РМЖ.

1. Bcl-2 влияет на такие важнейшие клеточные программы, как контроль над клеточным циклом и апоптоз. При РМЖ антипролиферативные функции Bcl-2 преобладают над антиапоптотическими, что проявляется статистически значимым повышением индекса Ki-67 в опухолях с отсутствием экспрессии Bcl-2 по сравнению с Bcl-2-положительными.

2. 14% всех Bcl-2-положительных РМЖ характеризуются отсутствием экспрессии ER. Они принадлежат к HER2/neu(+) и тройному негативному молекулярно-генетическим подтипам РМЖ. 33% опухолей с отсутствием экспрессии Bcl-2, наоборот, являются ER(+) и принадлежат к люминальному В подтипу. Среди люминальных А опухолей не обнаруживается случаев с потерей экспрессии Bcl-2.

3. Утрата экспрессии Bcl-2 люминальными В опухолями может свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе, так как наряду с увеличением уровня пролиферации в клетках этих опухолей нарастает и генетическая нестабильность, маркером которой служат комплексные генетические перестройки на хромосоме 17, такие как амплификация HER2/neu и/или региона CEP17.