Введение
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) удерживают лидирующую позицию среди неинфекционных заболеваний и причин смертей в мире [1]. В Российской Федерации зафиксировано более 855 000 смертей от ССЗ за 2018 г. [2]. Для лечения тяжелых форм ишемической болезни, пороков сердца, проведения замены клапанов остаются наиболее предпочтительными операции на «открытом» сердце в условиях искусственного кровообращения (ИК) [3]. Применение современных протоколов кардиоплегии во время ИК призвано сбалансировать энергозатраты миокарда в период аноксии [4—6].
Однако обеспечение стойкой энергетической стабилизации сердца при ИК не всегда представляется возможным в силу сопутствующей патологии у пациента. Существующие методы мониторинга состояния пациента во время операции позволяют проводить только стандартизированную тактику по минимизации ишемических и реперфузионных повреждений. Индивидуальный и более точный подход в коррекции ишемических и реперфузионных повреждений может предоставить интраоперационный мониторинг (online-мониторинг) динамики индикаторных метаболитов сердца. Бесконтактная оценка метаболического статуса миокарда in situ, основанная на оптическом методе — лазерно-индуцированной флюоресценции (ЛИФ) — отличается высокой точностью и простотой в применении. Данная разработка уже прошла этап изучения эффективности как на животной модели [7—9], так и на пациентах кардиохирургического профиля. Полученные результаты флюоресцентной контрастности ткани соответствовали классическим методам мониторинга и отражали состояние миокарда в период ишемии и реперфузии [10, 11]. Волокнистая основа сердечного внеклеточного матрикса (ВКМ) — коллагеновые и эластические волокна, удерживающие все структуры ткани миокарда, обеспечивает слаженное функционирование органа, способного выдержать циклические механические нагрузки [12, 13]. Степень сохранности белков ВКМ на фоне ишемии и реперфузии миокарда может дать оценку проведенной кардиоплегии и состоянию самого миокарда. За деструкцию белков ВКМ в значительной степени ответственна группа матриксных металлопротеиназ (MMPs) [14].
В физиологических условиях в сердце неактивные формы MMPs синтезируются и локализируются в лизосомах фибробластов, кардиомиоцитов в малом количестве [15]. Однако активные формы кислорода, неизбежно образующиеся в период ишемии и реперфузии органа, запускают многие метаболические превращения, в том числе активируют синтез MMPs [16]. MMP-3 является одним из ключевых ферментов ремоделирования ВКМ, обладает протеолитической активностью в отношении коллагенов (II, III, IV, V, VII, IX, X, XI типов), эластина, фибронектина и других структур ВКМ, активирует про MMP-1, про MMP-7, про MMP-9 [17]. Естественное предупреждение протеолиза собственных тканевых структур в рассматриваемом случае — накопления активной формы MMP-3, происходит через ее связывание с тканевым ингибитором матриксных протеиназ 1-го типа (TIMP-1) в стехиометрическом соотношении 1:1 или α2-макроглобулином [18]. Сравнительный анализ интенсивности флюоресценции белков ВКМ и иммуногистохимического окрашивания на детекцию MMP-3 и TIMP-1 в ткани миокарда позволит более углубленно изучить метод ЛИФ в отношении пригодности для кардиомониторинга в режиме реального времени [12].
Цель исследования — оценить эффективность оптической биопсии миокарда in situ методом ЛИФ в сравнении с результатами иммуногистохимического и гистологического исследования миокарда.
Материал и методы
Тестирование методики ЛИФ осуществлено в период с января 2017 г. по ноябрь 2018 г. на 15 пациентах кардиохирургического профиля на базе Томского НИМЦ в рамках испытаний first in men и после одобрения данного протокола локальными этическими комитетами НИИ КПССЗ и Томского НИМЦ. Средний возраст пациентов составил 60,0±9,4 года.
Критерии включения пациентов: возраст старше 18 лет, наличие органического сердечного заболевания, являющегося показанием к хирургическому лечению в условиях ИК (пороки клапанов сердца), подписанное пациентом информированное добровольное согласие на участие в исследовании.
Критерии исключения пациентов: возраст до 18 лет, признаки вторичной кардиопатии, реоперации на сердце, полиорганная недостаточность, фракция выброса левого желудочка менее 40%, декомпенсированная коморбидная патология, острый коронарный синдром, адгезивный перикардит, комбинированные вмешательства на открытом сердце, отказ пациента от участия в исследовании.
Лазерно-индуцированная флюоресценция
Тестирование нового интраоперационного мониторинга миокарда методом ЛИФ проводили наряду с рутинными методами оценки повреждения миокарда (запись ЭКГ, эхокардиография, исследование сердечных тропонинов). Метод ЛИФ основан на регистрации флюоресценции (спектра вторичного излучения) миокарда при его зондировании лазерным излучением в ультрафиолетовом спектре (λ=365 нм). Регистрировали показатели флюоресценции таких веществ, как коллаген, эластин, восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (НАДН), пиридоксин, флавины, липофусцин. Однако для настоящего сравнительного исследования выбраны компоненты ВКМ коллаген и эластин в силу наиболее частого упоминания этих маркеров в литературе. Для регистрации показателей ЛИФ использовали световой зонд одноканального диагностического аппарата «ЛАЗМА» (ООО НПП «ЛАЗМА», Россия).
Коэффициент контрастности флюоресценции биоткани определяли по формуле:
Kf=1+(If—Il)/(If—Il),
где If — максимум (пик) интенсивности флюоресценции биологического вещества; Il — максимум интенсивности возбуждения.
Учитывая небольшую глубину зондирования прибора (до 8 мм), для оценки эффективности метода ЛИФ выбрали миокард правого предсердия. Интраоперационно снимали показания с 3 областей миокарда: интактного (1), после нетрансмуральной радиочастотной аблации (2), после трансмуральной радиочастотной аблации (3). Необходимую нетрансмуральную и трансмуральную радиочастотную аблацию выполняли до и после окклюзии аорты. Регистрировали показатели в следующих точках: до окклюзии аорты (1); после кардиоплегической индукции (2); перед снятием зажима с аорты (3); после окончания искусственного кровообращения (4).
Кардиоплегию проводили раствором «Кустодиол» (Dr. F. Köhler Chemie GmbH, Германия), t=6 °C, в общей дозе 25—30 мл на 1 кг массы тела в течение 8 минут в два этапа: 50% дозы антеградно в коронарные артерии и 50% дозы ретроградно в коронарный синус.
Операции выполнены в условиях непульсирующего нормотермического ИК с перфузионным индексом 2,3 л/мин/м2 и стандартизированной методики объема первичного заполнения и кардиоплегии.
Иммуногистохимическое исследование (ИГХ)
Для детекции MMP-3 и TIMP-1 на парафиновых срезах сердца использовали кроличьи неконъюгированные антитела (Invitrogen, США) в разведении 1:100 для каждого интересующего агента. Время инкубации составило 45 мин. После инкубации с первичными антителами срезы промывали фосфатным буфером. Далее в течение 30 мин при 25 °C проводили инкубацию образцов со вторичными козлиными антителами, ковалентно связанными с полимером и пероксидазой — Goat anti-rabbit HRT-conjugate (Abcam, Великобритания). Затем на срезы наносили хромоген — диаминобензидин (Abcam, Великобритания). Степень ИГХ-реакции оценена по интенсивности окрашивания интересующих агентов: «–» — ИГХ-реакция отрицательная (искомого агента нет), «+» — ИГХ-реакция слабо положительная (искомого агента мало), «++» — ИГХ-реакция умеренно положительная, «+++» — ИГХ-реакция выраженно положительная (искомого агента много).
Гистологическое исследование
Гистологические препараты миокарда окрашены по методике Ван Гизона. Оценку гистологической картины каждой исследуемой группы проводили с использованием микроскопа AXIO Imager A1 (Carl Zeiss, Германия) в отраженном свете при увеличении ×100 и ×200.
Статистическая обработка
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе Graph Pad Prism 7. Нормальность распределения величин определяли с применением критерия Колмогорова—Смирнова. Результаты представлены графически в виде медианы и квартилей Me (25%; 75%). При множественном сравнении количественных величин применяли метод дисперсионного анализа ANOVA с поправкой Tukey. Различия между величинами считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Ранее проведены первые испытания метода ЛИФ на модели изолированного сердца крысы, подвергшегося кардиоплегической ишемии и реперфузии. Разработанный экспериментальный метод заключался в адаптации ключевых этапов операции в условиях искусственного кровообращения на животных для получения наиболее точной оценки эффективность ЛИФ. Установлены статистически значимые изменения Kf НАДН ткани миокарда в зависимости от метаболического статуса ткани [7]. Выявлена сильная корреляционная связь между Kf НАДН и сБСЖК, тропонином I, органическими перекисями [8]. Перспективные результаты, полученные на животной модели, позволили подойти к следующему этапу испытания метода ЛИФ на пациентах кардиохирургического профиля. Этот этап включил в себя не только установление эффективности метода оптической биопсии миокарда человека на разных этапах операции в условиях ИК и кардиоплегии, но и верификацию метода с позиции сопоставления показателей функциональной активности ферментов дыхательного цикла с гистологической и иммуногистохимической картиной миокарда разной степени повреждения в ходе операции и кардиоплегии [10, 11]. В данной статье представлены материалы сравнения флюоресценции белков сердечного внеклеточного матрикса с иммуногистологической картиной миокарда с этих же зон.
Радиочастотная аблация, проведенная пациентам по показаниям, позволила выделить 3 области миокарда для изучения целевых показателей в зависимости от степени повреждения ткани: интактный миокард, нетрансмуральное и трансмуральное повреждение миокарда. Метод ЛИФ продемонстрировал отсутствие статистически значимых различий между Kf коллагена как внутри группы с изменением этапа операции, так и между разной степенью повреждения ткани (табл. 1).
Таблица 1. Флюоресценция коллагена в зависимости от степени повреждения миокарда и времени снятия показателей методом лазерно-индуцированной флюоресценции
| Степень повреждения миокарда | Этап снятия показателей лазерно-индуцированной флюоресценции | ||
| До окклюзии аорты | Начало окклюзии аорты | Конец окклюзии аорты | |
| Интактный миокард, усл. ед. | 1,21 (0,94; 1,82) | 1,76 (1,57; 1,86) | 1,62 (1,49; 1,93) |
| Нетрансмуральное повреждение, усл. ед. | 1,60 (1,30; 1,68) | 1,56 (1,50; 1,77) | 1,61 (1,45; 1,82) |
| Трансмуральноеповреждение, усл. ед. | 1,72 (1,08; 1,84) | 1,55 (1,26; 1,78) | 1,59 (1,32; 1,63) |
Примечание. Данные представлены в виде Me (25%; 75%).
Флюоресценция эластина также не имела особенностей в интенсивности между зависимыми и независимыми группами сравнения поврежденных аблацией тканей. Но в области зондирования интактного миокарда в начале окклюзии зарегистрировано статистически значимое повышение флюоресценции эластина (Kf (1,95 (1,91; 1,98) усл. ед.), p<0,05), что может говорить о возможных конформационных изменениях белка ввиду его растяжимых свойств [19]. К концу окклюзии аорты Kf эластина снизился и не имел статистически значимых отличий от Kf эластина, зарегистрированного до окклюзии (1,70 (1,27; 1,95) усл. ед.) (табл. 2).
Таблица 2. Флюоресценция эластина в зависимости от степени повреждения миокарда и времени снятия показателей методом лазерно-индуцированной флюоресценции
| Степень повреждения миокарда | Этап снятия показателей лазерно-индуцированной флюоресценции | ||
| До окклюзии аорты | Начало окклюзии аорты | Конец окклюзиии аорты | |
| Интактный миокард, усл. ед. | 1,70 (1,27; 1,95) | 1,95* (1,91; 1,98) | 1,88 (1,82; 1,95) |
| Нетрансмуральное повреждение, усл. ед. | 1,87 (1,70; 1,94) | 1,87 (1,86; 1,98) | 1,76 (1,70; 1,85) |
| Трансмуральное повреждение, усл. ед. | 1,90 (1,76; 1,97) | 1,92 (1,85; 1,97) | 1,80 (1,72; 1,88) |
Примечание. Данные представлены в виде Me (25%; 75%). * — p<0,05 по сравнению с показателями интактного миокарда до окклюзии.
Иммуногистохимическое окрашивание миокарда позволило определить локализацию, степень накопления и функциональную активность MMP-3 и TIMP-1 в интересующих зонах миокарда.
Согласно данному анализу, MMP-3-иммунопозитивные клетки располагались диффузно исключительно в строме миокарда. Структурная особенность клеток соответствовала фибробластам с характерной отростчатой формой и центрально расположенным продолговатым ядром, а также макрофагам с полигональной формой и овальным ядром в центре (рис. 1 на цв. вклейке).
Рис. 1. Иммуногистохимическое окрашивание среза миокарда человека для выявления в ткани матриксной металлопротеиназы-3 (ув. 200).
MMP-3 определялась в секреторных везикулах иммунопозитивных клеток и представлена в форме проматриксной (неактивной) MMP-3. Параллельно обнаружена иммунопозитивная реакция на наличие MMP-3 в межклеточном пространстве, но в значительно меньшей степени. Интенсивность ИГХ-окрашивания варьировала в узких границах и была умеренно положительная (++). В зоне интактного миокарда и нетрансмурального повреждения в 50% случаев наблюдали незначительный рост интенсивности реакции окрашивания, в остальных случаях динамика не зафиксирована. В зоне трансмурального повреждения в 50% случаев также имелся незначительный рост интенсивности реакции ИГХ-окрашивания, но в 33,3% зафиксирован незначительный спад реакции. В целом можно сделать заключение о незначительном накоплении MMP-3 и наименьшем выходе и активации фермента во внеклеточном пространстве вне зависимости от изучаемой области миокарда без выраженной динамики на разных этапах операции.
Структурные особенности TIMP-1-иммунопозитивных клеток миокарда соответствовали кардиомиоцитам и фибробластам. В ходе анализа ИГХ-снимков закономерные визуальные различия интенсивности TIMP-1-окрашивания между сравниваемыми зонами миокарда не выявлены. Интенсивность окрашивания лежала в границах от слабоположительной (+) до умеренной (++). Локализация TIMP-1 была исключительно внутриклеточной и преобладала в кардиомиоцитах и не менялась в течение разных этапов операции (рис. 2 на цв. вклейке).
Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание среза миокарда человека для выявления в ткани ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 (ув. 200).
Отсутствие или минимальный выход MMP-3 в межклеточное пространство и одновременная сохранность внутриклеточной локализации TIMP-1 косвенно свидетельствовали об отсутствии протеолиза белковых структур ВКМ. Адекватный режим кардиоплегии позволил стабилизировать биохимические процессы в клетках, замедлить образование активных форм кислорода и инициирование образования активного MMP-3 и его выход в межклеточное пространство.
Классическое гистологическое окрашивание срезов миокарда также подтвердило сохранность структуры ткани. Идентифицировано чередование участков сокращения (более насыщенный цвет) с участками растяжения мышечных волокон (более бледная окраска). Отсутствие обширных равноокрашенных областей ткани говорит о сохранности способности разных зон миокарда к сокращению. Не обнаружена фрагментация или волнообразная деформация мышечных волокон миокарда, волокна в исследуемых препаратах идут параллельно друг другу (рис. 3 на цв. вклейке).
Рис. 3. Типичное гистологическое изображение среза миокарда.
Окраска по Ван Гизону (ув. 100).
Заключение
Метод лазерно-индуцированной флюоресценции продемонстрировал сохранность компонентов внеклеточного матрикса — коллагена и эластина, — представленную в виде коэффициентов флюоресценции каждого белка. Флюоресцентная картина полностью соответствовала иммуногистохимическому окрашиванию ткани миокарда на наличие и локализацию матриксной металлопротеиназы-3 и ингибитора матриксных металлопротеиназ 1-го типа: в межклеточном матриксе матриксная металлопротеиназа-3 отсутствовала либо находилась в минимальном количестве, в основном депонируясь внутриклеточно; ингибитор протеиназ 1-го типа также идентифицировался исключительно внутриклеточно. Метод лазерно-индуцированной флюоресценции показал свою эффективность при интраоперационном мониторинге состояния миокарда пациентов в ходе кардиохирургических вмешательств.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.