На сегодняшний день хирургия открытого сердца в условиях искусственного кровообращения является одним из основных способов лечения различных социально важных сердечно-сосудистых заболеваний. Одновременно сохраняется и высокая потребность в поддержке жизнеспособности донорских органов для последующей трансплантации, так как именно трансплантация является ведущим способом решения проблемы терминальной недостаточности сердца. В обоих случах миокард временно лишается системного коронарного кровотока и подвергается ишемии и реперфузии, что зачастую приводит к возникновению различных осложнений (послеоперационный станнинг, синдром малого сердечного выброса, постперфузионные нарушения ритма) [1]. В итоге патологические изменения в миокарде не только ухудшают послеоперационное восстановление, но и влияют на функционирование других органов в силу воздействия результирующего синдрома малого сердечного выброса на формирование гипоперфузионной полиорганной недостаточности [2]. В связи с изложенным тема кардиопротекции как вариант профилактики ишемического и реперфузионного повреждений миокарда весьма актуальна. Рассматривая ее в ракурсе эксперимента, в первую очередь следует обратить внимание на спектр препаратов, способных обеспечить фармакологический вариант кардиопротекции, а также отметить специфику построения этапов моделирования ишемии и реперфузии в эксперименте.

Одним из последствий процесса ишемии органов, в том числе миокарда, является нарушение переноса электронов в дыхательной цепи и обусловленная этим невозможность реализации митохондриальным аппаратом важнейшей задачи — синтеза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Установлено, что митохондрии кардиомиоцитов продуцируют данную макроергическую молекулу аэробным путем в количестве, более чем в 15 раз превышающем массу сердца [3]. В условиях ишемии при переходе метаболического пути образования энергии на анаэробный гликолиз возникает дефицит АТФ с дальнейшим усугублением его синтеза в сочетании с нарушением работы ионных каналов [4, 5] и возможным индуцированием апоптоза кардиомиоцитов [6].

С позиции обоснования коррекции вероятной клеточной энергетической недостаточности представляется актуальным уточнение в процессе экспериментального исследования фармакологических эффектов таких препаратов, как левосимендан и экзогенный фосфокреатин.

Получено достаточное количество данных о левосимендане, который используют для лечения при острой сердечной декомпенсированной недостаточности; этот препарат оказывает инотропное, вазодилатирующее, кардиопротективное, а также антиоксидантное и противовоспалительное действие [7—11]. Кардиопротективный эффект левосимендана проявляется в регулировании АТФ-чувствительных калиевых каналов митохондрий кардиомиоцитов, что приспосабливает ферментативные комплексы дыхательной цепи к потребности клеток в АТФ [12]. Известно, что на фоне сложности и многообразия клинических случаев левосимендан не всегда является действенным препаратом [13]. Для сравнения выбрано вещество, также влияющее на процессы энергетического баланса в ткани миокарда.

Проведенный F. Mingxing и соавт. [14] метаанализ результативности применения фосфокреатина для восстановления сердечной деятельности по сравнению со стандартным лечением включал 26 рандомизированных исследований с участием 1948 пациентов. Установлено, что при применении фосфокреатина снижалась частота интраоперационной инотропной поддержки, случаев аритмий, повышалось количество эпизодов спонтанного восстановления сердечного ритма после декомпрессии аорты. Фосфокреатин вызывает ряд эффектов в отношении ишемизированного миокарда: устанавливает баланс потребления АТФ, стабилизирует клеточную мембрану, а также обладает антиоксидантными свойствами. Фосфокреатин является компонентом фосфотранспортной системы, играющей одну из ключевых ролей в обеспечении энергетических потребностей миокарда [15]. Фосфокреатин с участием креатинкиназы отдает фосфатные группы аденозиндифосфату, в результате чего происходит образование АТФ в местах ее утилизации — это миофиламенты, саркоплазматический ретикулум, клеточная мембрана и другие структуры [16]. Доказано, что фосфокреатин истощается одним из первых при развитии ишемии, поэтому восполнение его запасов представляется перспективным направлением в обеспечении миокарда энергией [17].

Таким образом, каждый из описанных выше препаратов оказывает достаточно мощное фармакологическое действие. Однако в мировой литературе не освещены вопросы использования указанных препаратов при проведении экспериментальной кардиоплегической ишемии миокарда. Напомним, это состояние является необходимым как при проведении ряда операций на открытом сердце, так и при доставке донорского органа к месту трансплантации.

Цель исследования — изучить фармакологические эффекты левосимендана и экзогенного фосфокреатина на модели глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца крысы в условиях 4-часового кардиоплегического ареста.

Эксперименты проведены с использованием здоровых взрослых самцов крыс линии Wistar (средняя масса 300±50 г). Животные содержались в стандартных условиях вивария без ограничения в пище и воде. Эксперименты и процедуры над лабораторными животными проведены в соответствии с правилами Европейской конвенции (Страсбург, 1986).

В 1-ю опытную группу (ЛС) включены сердца крыс (n=7) с фармакологической поддержкой левосименданом, во 2-ю опытную группу — сердца крыс (n=7) с поддержкой экзогенным фосфокреатином (ЭФК), в контрольную группу (n=7) — сердца крыс, на которые не оказывали дополнительное фармакологическое воздействие.

Животным проводили анестезию путем введения тиопентала натрия (25 мг на 1 кг массы тела) внутрибрюшинно. Посредством торакотомии вырезали сердце и немедленно погружали его в раствор Кребса—Хензеляйта (T=4 °С). Далее в аорту вводили канюлю и сердце подключали к системе перфузирования с подачей стандартного раствора Кребса—Хензеляйта, обогащенного смесью газов — 95% O₂ и 5% CO₂; рН 7,3—7,4; Т 37—38 °С, при постоянном давлении 80 см вод.ст.

Адаптивная перфузия — 20 мин; кардиоплегия (20 мл/ч) охлажденным (4 °С) кардиоплегическим раствором Кустодиол («Dr. F. KOHLER CHEMIE, GmbH», Германия) 8 мин; глобальная кардиоплегическая ишемия 240 мин; реперфузия 30 мин. Сердца группы ЛС в начальные 8 мин реперфузии перфузировали раствором Кребса—Хензеляйта, в который добавляли препарат с действующим веществом левосимендан симдакс («Orion Corporation», Финляндия). Пересчет начальной дозы препарата производили с учетом массы сердца, она составила 0,014 нг на 2±0,2 г массы сердца крысы. Сердца группы ЭФК перфузировали аналогично, добавляя в перфузионный раствор препарат с действующим веществом фосфокреатин неотон («Alfa Wassermann», Италия). Пересчет дозы производили аналогичным образом, она составила 5,7 нг на 2±0,2 г массы сердца крысы.

На исходной точке, на 10-й и 30-й минутах реперфузионного периода регистрировали скорость коронарного протока (СКП, мл/мин), частоту сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин), давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ, мм рт.ст.), при помощи аппарата для физиологических исследований МР36 («Biopac Systems, Inc», США). Активность ферментов креатинфосфокиназы — миокардиальной фракции (КФК-МБ, Ед/л), лактатдегидрогеназы (ЛДГ, Ед/л), аспартатаминотрансферазы (АСТ, Ед/л) определяли методом ферментативной кинетики на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab 30i («Thermo Fisher Sсientific», Финляндия). Концентрацию сердечного белка, связывающего жирные кислоты (сБСЖК, нг/мл), и тропонина I (Troponin I, пг/л) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием специальных наборов — «Hycult biotech», США и «CUSABIO BIOTECH Co., Ltd», КНР соответственно. Количественное содержание перекиси и оксида азота (NO₂) установлено ИФА-исследованиями при помощи специальных наборов «Biomedica» (Австрия) и «Research & Diagnostics Systems, Inc.» (США).

Регистрация динамики флуоресценции одного из основных участников окислительного метаболизма — восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) осуществлена на комплексе многофункциональной лазерной диагностики ЛАКК-М («ООО НПП Лазма», Россия) в доишемическом периоде (исходная точка), на 10-й и 30-й минутах реперфузионного периода.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica 6.0. Наличие разницы в регистрируемых показателях определяли с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни и критерия Вилкоксона. Различия между группами принимали статистически значимыми при р<0,05. Применена поправка Бонферрони на множественные сравнения. Данные в разделе «Результаты» представлены как медиана Me (Q₂₅; Q₇₅) в виде графиков, а также в виде полученных значений в исследуемом диапазоне или конкретной точке: доишемический уровень (Исх) и реперфузионный период 10—30-я минуты (РП 10´—30´) или 10-я и 30-я минуты (РП 10´ и РП 30´).

СКП в группе «ЛС» составила 13,2 (8,8; 16,7)—11,75 (8,6; 14,1) мл/мин и в 1,7 раза превысила исходные значения в контрольной группе — 7 (5,1; 12)—6,6 (5,5; 10) мл/мин и значения в группе ЭФК — 8 (6,2; 10,3)—7,3 (5,7; 10,5) мл/мин в реперфузионном периоде (рис. 1, а).

ЧСС в контрольной группе составила 297,5 (290; 303) уд/мин (p=0,02), в группе ЛС — 162,5 (155,5; 188) уд/мин (p=0,03) и на 10-й минуте реперфузионного периода статистически значимо отличалась от доишемических значений. Значения ЧСС в опытных группах имели статистически значимые различия с показателями контрольной группы в периоде экспериментальной реперфузии. ДРЛЖ в группах ЛС и ЭФК (см. рис. 1, в) соответственно достигло 10´— 30´: 136,5 (128; 139) — 77 (69; 81) мм рт.ст. и 10´— 30´: 103 (99; 110) — 71,5 (68; 75) мм рт.ст., что было статистически значимо выше (p<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе — 10´— 30´: 32,5 (29; 40) — 39 (36; 42) мм рт.ст. в исследуемых точках возобновленной перфузии миокарда.

Выход АСТ в оттекаемый от сердца перфузионный раствор (рис. 2, а)

Концентрация сБСЖК (рис. 3, а)

Уровень флуоресценции НАДН (рис. 4)

Левосимендан влияет на открытие АТФ-чувствительных калиевых каналов в мембране гладкомышечных клеток сосудистой стенки. Вследствие этого возникает гиперполяризация мембраны, которая приводит к расслаблению гладких мышц и вазодилатации [18, 19]. Наше исследование показало, что при добавлении в раствор Кребса—Хензеляйта левосимендана в дозе 0,014 нг на 2±0,2 г массы сердца крысы скорость коронарного протока на начальном этапе реперфузии увеличилась, и в отличие от других групп держалась на одном уровне, что говорит о проявленном вазодилатирующем эффекте данного препарата. Экзогенный фосфокреатин не оказал влияния на тонус коронарных сосудов в постишемическом периоде: кривая СКП аналогична таковой в контрольной группе. Функциональное состояние миокарда в опытных группах после 4-часовой гипотермической ишемии было схожим. Как в группе ЛС, так и в группе ЭФК не зарегистрировано увеличение ЧСС на начальном периоде возобновленной перфузии, чего нельзя сказать о контрольной группе, в которой ЧСС на 10-й минуте реперфузии возросла в среднем на 100 уд/мин. Наивысший пик роста ДЛРЖ отмечен в группе ЛС на 10-й минуте реперфузии. Достигнут инотропный эффект [19] левосимендана: повысилась аффинность тропонина С к ионам кальция и стабилизировался тропонин С—кальциевый комплекс. При введении в состав перфузионного раствора экзогенного фосфокреатина также отмечено увеличение ДРЛЖ. В данном случае можно говорить о поддержании необходимого уровня фосфокреатина в клетке и сарколеммных пулах [20, 21]. Полученная энергия обеспечила должное сокращение миокарда. По данному разделу можно сделать вывод: реперфузионный период в группах с фармакологической поддержкой протекал менее осложненно по сравнению с контрольной группой.

Картина выброса внутриклеточных ферментов в каждой исследуемой группе имела свои особенности. Если говорить о левосимендане, то уровень активности АСТ, КФК-МБ не превышал доишемические значения и держался на низком уровне после длительного эпизода ишемии. Однако активность ЛДГ на 10-й минуте реперфузии была минимальной относительно других групп, но возросла к концу эксперимента. В присутствии левосимендана несколько снижен потенциал митохондрий к продукции энергии аэробным путем. Применение экзогенного фосфокреатина в целях защиты миокарда и постишемического восстановления в ряде экспериментальных моделей продемонстрировало свою эффективность, в том числе в уменьшении выхода таких внутриклеточных ферментов, как КФК-МБ, ЛДГ, миелопероксидазы [22—24]. В нашем эксперименте получены неоднозначные результаты. На 10-й минуте реперфузии после введения экзогенного фосфокреатина установлен самый высокий уровень активности всех исследуемых ферментов, который к концу эксперимента снизился до уровня в других исследуемых группах. Доза препарата (5,7 нг на 2±0,2 г массы сердца) повлияла на некоторые метаболические изменения, но была недостаточной. Возможно, поэтому только к концу эксперимента сыграл свою роль мембраностабилизирующий эффект фосфокреатина — произошло обеспечение электростатического взаимодействия между заряженными центрами молекулы фосфокреатина и заряженными головками фосфолипидов мембран [25], в результате чего закрылись дефекты фосфолипидного слоя, полученные в начале реперфузии. Контрольная группа отличилась относительно низкой ферментативной активностью ЛДГ и КФК-МБ, но все же неуклонный рост АСТ, который к 30-й минуте реперфузии превысил показатели в опытных группах, свидетельствовал о постишемической деструкции сарколеммы кардиомиоцитов.

Характер высвобождения внутриклеточного сБСЖК у всех групп был схож, однако в контрольной группе значения данного белка в реперфузионном периоде статистически значимо отличались от таковых в доишемическом периоде. Все-таки максимальные мембранные повреждения отмечены в контрольной группе. Рассматриваемые препараты в выбранных дозах оказали в разной степени стабилизирующий эффект на билипидный слой. Одновременно со стабилизацией клеточной мембраны левосимендан и экзогенный фосфокреатин в равной степени способствовали структурному сохранению сократительного аппарата миокарда. Образование органических перекисей в периоде реперфузии не превысило доишемический уровень при фармакохолодовой кардиоплегии без фармакологической поддержки. Оказанная же поддержка в обоих случаях увеличила образование органических перекисей при возобновленном доступе кислорода к ишемизированному органу к концу эксперимента.

NO является липофильной молекулой, имеющей непарный электрон, благодаря чему он беспрепятственно диффундирует через биологические мембраны и вступает в реакции с другими соединениями [26]. NO, связываясь с гуанилатциклазой, усиливает синтез циклического гуанозинмонофосфата. В клетке гладкой мускулатуры данное соединение снижает концентрацию кальция, что вызывает вазодилатацию [27, 28]. По итогам проведенных экспериментов получены некоторые противоречивые данные о концентрации эндогенного NO, вышедшего в миокардиальный отток, и СКП. Так, если в контрольной группе продукция NO на протяжении всего периода реперфузии была равной исходным значениям, то СКП была минимальной. Ситуация с дополнительной фармакологической поддержкой левосименданом подтверждает наличие вазодилатирующего эффекта с поддержанием синтеза NO [29]. При применении фосфокреатина СКП и продукция NO были наименьшими в исследуемых группах.

Неудовлетворительная оценка поставлена всем исследуемым группам при анализе данных, полученных методом лазерно-индуцированной флуоресценции. НАДН, накопленный во время ишемии, при возобновлении перфузии перешел в окисленную форму, что отразилось в уменьшении коэффициента флуоресценции на 10-й и 30-й минутах реперфузионного периода. Хотя минимальный рост флуоресценции и зафиксирован в опытных группах, все же электротранспортная цепь дыхательного аппарата кардиомиоцитов подверглась глубоким повреждениям.

Фармакохолодовая 4-часовая кардиоплегическая ишемия вызвала в изолированных сердцах тяжелые нарушения внутриклеточных процессов, в частности митохондриальных. Фармакологическая поддержка такими агентами, как левосимендан и экзогенный фосфокреатин в дозах 0,014 и 5,7 нг на 2±0,2 г массы сердца крысы соответственно, в нашем экспериментальном исследовании вызвала в ишемизированном миокарде не весь перечень эффектов, которые получены при других видах экспериментальной ишемии и реперфузии.

1. Левосимендан и экзогенный фосфокреатин способствовали постишемическому восстановлению физиологических показателей, стабилизации клеточной мембраны и сократительного комплекса ишемизированного миокарда.

2. Выявленные нарушения внутриклеточного метаболизма требуют пересмотреть выбор концентрации препаратов. С большей вероятностью можно говорить, что доза фосфокреатина в перфузионном растворе должна быть выше, так как его недостатком является быстрое дефосфорилирование и распад как в кровотоке, так и тканях.

3. Другим вариантом усиления действия левосимендана и фосфокреатина может стать их комбинация с антиоксидантом, который смог бы снизить образование активных форм кислорода.

Финансирование. Исследование не имело финансовой поддержки.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Сенокосова Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-9430-937X

Крутицкий C.С. — https://orcid.org/0000-0001-5378-7466

Великанова Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-1079-1956

Цепокина А.В. — https://orcid.org/0000-0002-4467-8732

Кузьмина А.А. — https://orcid.org/0000-0002-4807-7686

Третьяк В.М. — https://orcid.org/0000-0003-1135-9839

Денисова С.В. — https://orid.org/0000-0002-8290-0752

Груздева О.В. — https://orcid.org/0000-0002-7780-829X

Антонова Л.В. — https://orcid.org/0000-0002-8874-0788

Григорьев Е.В. — https://orcid.org/0000-0002-3898-0740

Автор, ответственный за переписку: Сенокосова Е.А. — ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», 650002, Кемерово, Россия. e-mail: sergeewa.ew@yandex.ru