Ожирение является значимым фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), сахарного диабета (СД) 2-го типа, метаболического синдрома и некоторых видов рака [1—5]. Этиология ожирения представляет собой взаимодействие между образом жизни, окружающей средой и генетическими факторами [6—9]. Показана ассоциация более 30 одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP — Single Nucleotide Polymorphism) с индексом массы тела (ИМТ) [9, 10]. В последнее время изучают вклад эпигенетических факторов в развитие ожирения путем оценки уровня метилирования ДНК CpG-островков и изменение в организации хроматина в результате модификации гистонов [6, 11]. Новые технологические достижения дали возможность для систематического исследования изменения метилирования ДНК в геноме с целью исследования ассоциаций эпигенома (Epigenome-Wide Association Studies — EWAS), выявляя регионы генома с вариациями метилирования ДНК, связанных с фенотипами болезней [12—14]. В настоящее время выявлено 19 генов, различия в уровне метилирования которых ассоциированы с ожирением: ATP10A, BBS2, C7orf50, CD44, CPT1A, DHCR24, FTO, HIF3A, KDM2B, PBX1, PHGDH, PRR5L, RALB, RNF145, TRIM3, VPS25, WT1, ZNF710, ZNF862 [13, 15—19]. В то же время возможность обратимости метилирования в ответ на диетическую коррекцию остается малоизученной. В единственном исследовании F. Milargo и соавт. [15] было показано, что при 8-недельном ограничении калорий у 25 мужчин уровень метилирования CpG островков WT1 промоутера статистически различался между группой с хорошим ответом на диету и группой без ответа.

Цель настоящего исследования — изучение динамики профиля метилирования генов, ассоциированных с ожирением, при диетологической коррекции, направленной на снижение массы тела в рамках проспективного когортного исследования.

В исследование включались пациенты с ожирением I—III степени без клинических проявлений ССЗ, прошедших амбулаторное обследование в ФГБУ «Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины» Минздрава России и обратившихся за диетологической помощью в кабинет медицинской профилактики в 2012—2013 гг. Критериями исключения были любые хронические соматические заболевания, в том числе ССЗ, артериальная гипертензия (АГ) III степени, СД 2-го типа, онкологические заболевания, регулярный прием гипотензивных, гиполипидемических и сахароснижающих препаратов, а также беременность, период лактации, отказ от участия в исследовании. Всеми пациентами было подписано информированное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ГНИЦ П.М. Более подробно дизайн исследования был описан ранее [20].

Всем пациентам проводилась оценка характера питания и выполнялось антропометрическое обследование. Оценка фактического питания пациентов выполнена с использованием компьютерной программы «Анализ состояния питания человека» версия 1.2.4. (разработчик ФГБНУ «НИИ питания»), проводилась исходно и через 12 мес.

Антропометрическое обследование пациента включало измерение роста, массы тела, окружности талии (ОТ) по стандартным методикам с последующим расчетом ИМТ (Индекса Кетле).

Рост пациента измеряли 2 раза: при первом и заключительном визитах, в положении стоя, без обуви. Результат оценивали с точностью до 0,5 см. Массу тела (МТ) измеряли однократно при каждом визите на медицинских весах с точностью до 100 г.

ИМТ определялся расчетным методом с использованием показателей массы тела и роста, выраженного в единице измерения — метр (м) по формуле: ИМТ=МТ (в кг)/рост² (в м). Оценка критериев ИМТ осуществлялась согласно рекомендованной ВОЗ «Классификации избыточной массы тела и ожирения» (1999, 2001, 2009).

Техника диетологического вмешательства. На 1-м визите после обследования всем пациентам был рекомендован редуцированный по суточной калорийности рацион питания с ограничительным потреблением насыщенных жиров, простых сахаров и продуктов с высоким гликемическим индексом, с оптимальным потреблением животного и растительного белка и с соответствующим количеством общих углеводом (преимущественно за счет сложных углеводов для обеспечения адекватного присутствия пищевых волокон). Индивидуальная коррекция рациона питания предполагала исключение отдельных пищевых продуктов при наличии у пациента пищевой аллергии или пищевой непереносимости к данному продукту. Каждый пациент после окончания первой консультации получал на руки предписанный рацион питания и дневник, где должен был регистрировать свои параметры: масса тела, ОТ и бедер (ОБ), количество пройденных шагов за день как критерий ежедневной двигательной активности (с этой целью использовали напоясный шагомер).

На 2-м (через 2 нед) и 3-м (через 4 нед) визите врачом-диетологом при необходимости проводилась коррекция рациона питания с учетом вкусовых пристрастий пациента, режима труда и отдыха, особенностей использования мест общественного питания, уточнялось соблюдение режима питания и объема двигательной активности.

Последующие визиты пациентов проходили 1 раз в месяц, и при необходимости врачом-диетологом осуществлялась коррекция рациона питания. Период редукции повышенной массы тела и наблюдения пациентов составил 12 мес (13 визитов в год).

В основную группу (группу вмешательства) были включены пациенты, у которых через 12 нед на фоне изменений характера питания зарегистрирована динамика основных антропометрических показателей: ОТ, ОБ и снижение массы тела не менее, чем на 5% от исходного значения.

Группу контроля составили пациенты, у которых на 4-м визите (через 12 нед от момента диетологического вмешательства) не было отмечено значимой динамики массы тела (5,0% и более от исходного значения). От дальнейших регулярных визитов к врачу-диетологу они были освобождены и были приглашены только для контрольного осмотра через 12 мес.

На 1-м и на последнем визите (через 12 мес) у всех пациентов проводили забор венозной крови натощак для определения профиля метилирования.

Изучение уровня метилирования с помощью микрочипов. ДНК была выделена из венозной крови с помощью QIAamp DNA Blood Mini Kit («Qiagen», США) в соответствии с протоколом. Концентрацию измеряли на Implen Nanophotometer («Implen», Германия). Для каждого образца использовали 5 мкг ДНК, соникированной на Covaris S220 («Covaris», США). Для иммунопреципитации применяли Dynabeads Pan Mouse IgG («Invitrogen», Нидерланды) и Anti-5-Methylcytidine Monoclonal Antibody («Eurogentec», Нидерланды). Подготовка образцов, мечение и обработка микрочипов Human DNA Methylation Microarrays 1×244K («Agilent», США) были выполнены согласно последней версии протокола компании «Agilent» (v2.2, 2014). Микрочипы были отсканированы на Innopsys InnoScan 900 («Innopsys», США) с настройками, рекомендованными компанией «Agilent».

Статистический анализ. Для статистической обработки результатов использовали пакет программы Statistica 6.0; p<0,05 рассматривали как статистически достоверное изменение.

На начальном этапе статистического анализа проводили проверку исследуемых количественных признаков на нормальность распределения. За нормальное распределение принимали то распределение, для которого критерий Шапиро—Уилка составлял более 0,05. Учитывая несоответствие нормальному распределению ряда сравниваемых признаков и малочисленность групп исследования, все данные представлены в виде медиана [25—75 процентили], а различия между независимыми группами выявляли с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни. При оценке изменений количественных показателей в динамике использовали критерий Уилкоксона.

Статистическую значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивали при помощи критерия Фишера (двусторонний тест).

Данные с микрочипов были получены с помощью программного обеспечения Agilent Feature extraction (v.12.0.0.7, «Agilent», США). Анализ исходных данных был выполнен с помощью пакетов в программной среде R: внутричиповая нормализация — с помощью пакета R ‘affy’ (функция normalize. loess), межчиповая нормализация — с помощью пакета R «preprocessCore» (функция normalize. quantiles). Общее количество CpG островков после удаления CpG островков с X и Y хромосом составило 235 336. Для визуализации дифференциально-метилированных CpG-сайтов использовали пакет «ggplot2» в программной среде R. Различия в уровне метилирования генов между группами представлены в виде медианы log2 отношений (отношение интенсивностей красного сигнала к зеленому), рассчитанной по группе.

Клиническая характеристика пациентов. В исследование был включен 21 пациент в возрасте от 30 до 74 лет. Через 1 год у 9 пациентов наблюдалось снижение массы тела более чем на 5% от исходного — в среднем на 10,5 кг (от 7,1 до 15,4 кг), а у 12 пациентов динамика массы тела отсутствовала — снижение менее чем на 5% от исходной величины, или в среднем на 1,6 кг (0,5—3,5 кг), различия между группами были достоверны (р<0,0001).

Клиническая характеристика пациентов представлена в таблице. Исходно группы не различались между собой по возрастно-половому составу, ИМТ на 1-м и последнем визите через 12 мес (ИМТ1 и ИМТпв соответственно). Однако при сравнении динамики ИМТ в каждой группе выявлена достоверная разница в группе снижения массы тела с 34,6 до 28,3 кг/м² (р=0,008), в группе без динамики массы тела достоверных различий нет.

Различия в уровне метилирования ДНК до диеты между пациентами со снижением массы тела и без ее динамики. Изменения в уровне метилирования оценивали в генах, ассоциированных в EWAS исследованиях с ожирением (19 генов): ATP10A, BBS2, C7orf50, CD44, CPT1A, DHCR24, FTO, HIF3A, KDM2B, PBX1, PHGDH, PRR5L, RALB, RNF145, TRIM3, VPS25, WT1, ZNF710, ZNF862 — всего 451 CpG островок) [13, 15—19].

Исходно обе группы отличались по 5 CpG островкам (p<0,05) генов RNF145, PRR5L, C7orf50 (2 CpG островка), ATP10A. CpG островки генов RNF145 и ATP10A были гипометилированы в обеих группах. Интересно, что CpG островки генов PRR5L и C7orf50 (chr7:1155437—1155481) были гипометилированы в группе со снижением веса и гиперметилированы в группе без динамики. В то же время C7orf50 (chr7:1068141—1068185) был гиперметилирован в группе со снижением массы тела и гипометилирован в группе без динамики (рис. 1). На рис. 1 данные по каждой группе представлены в виде медианы значений log2 от отношения интенсивностей красного сигнала к зеленому.

После вмешательства различия в уровне метилирования ДНК по генам EWAS были выявлены в 17 CpG островках: генов C7orf50 (6 CpG островков), KDM2B (2 CpG островка), VPS25 (2 CpG островка), ATP10A, HIF3A, PBX1, PHGDH, RNF145, WT1, ZNF710. Так 8 CpG островков были гипометилированы (генов WT1, RNF145, KDM2B (2 CpG островка), HIF3A, C7orf50 (chr7:1105391—1105435, chr7:1097622−1097666), ATP10A). 5 CpG островков были гиперметилированы (генов VPS25 (2 CpG островка), PBX1, PHGDH, C7orf50 (chr7:1040115—1040159)). В то же время CpG островки генов ZNF710 и C7orf50 (chr7:1131890—1131934, chr7:1048874—1048918) были гипометилированы в группе со снижением массы тела и гиперметилированы в группе без динамики, а CpG гена C7orf50 (chr7:1127829—1127873) — наоборот (рис. 2).

Изменение метилирования ДНК через 1 год применения методики диетологического вмешательства. При наблюдении изменений уровня метилирования генов EWAS, ассоциированных с ожирением, в зависимости от динамики массы тела было выявлено следующее: в группе снижения массы тела по сравнению с уровнем метилирования до диетического вмешательства CpG островки генов PRR5L, C7orf50 (chr7: 1155437—1155481) стали гиперметилированными, а CpG островки генов KDM2B (chr12:121974098—121974142) и C7orf50 (chr7:1131890—1131934, chr7: 1048874—1048918) — гипометилированными. В то же время в группе без динамики массы тела CpG генов C7orf50 (chr7:1068141—1068185) стал гиперметилированным, а C7orf50 (chr7:1127829—1127873) — гипометилированным (рис. 3, 4). Только один CpG островок гена RNF145 имел достоверные различия в уровне метилирования в обеих группах как до, так и после диеты.

Эпигенетический анализ клеток периферической крови является многообещающим подходом для диагностики заболеваний, оценки результатов лечения и поиска новых биомаркеров [15]. Ряд исследований проведены в попытке выявить закономерности изменения уровня метилирования ДНК у людей с ожирением или избыточной массой тела как по сравнению со здоровыми пациентами: (среди взрослых [5, 19] и у подростков [21]), так и под влиянием гипокалорийной диеты [15]. Как было отмечено ранее [15], эпигенетические маркеры могут быть полезны для выявления разных категорий людей, имеющих тенденцию к снижению массы тела под действием диеты и нет. Так, согласно данным, полученным с помощью транскриптомного анализа, не было выявлено различий между этими двумя группами до диеты [15, 22], в то же время на уровне эпигенома различия были получены [15, 23]. В то же время возможность обратимости метилирования в ответ на диетическую коррекцию остается малоизученной.

Цель настоящего исследования — изучение динамики профиля метилирования генов, ассоциированных с ожирением, при диетологической коррекции, направленной на снижение массы тела в рамках проспективного когортного исследования.

Мы выявили, что исходно группы достоверно различались по пяти локусам. CpG островок гена PRR5L до вмешательства был гипометилирован в группе со снижением массы тела и гиперметилирован в группе без динамики. Ген PRR5L (PROLINE RICH 5-Like) регулирует организацию цитоскелета, взаимодействует с МРМ (мишень рапамицина у млекопитающих), контролирует клеточный рост для повышения апоптоза [13].

Уровень метилирования гена C7orf50 сильно различался в разных CpG островках этого гена в группах со снижением массы тела и без динамики как до, так и после диеты. Этот ген является открытой рамкой считывания 50 хромосомы 7, функция которого неизвестна. Варианты GWAS в этом гене связаны с уровнем липидов и долголетием [13].

CpG островок гена ZNF710 был гипометилирован в группе со снижением массы телда и гиперметилирован в группе без динамики. Это протеинкодирующий белок, функция которого не известна, может быть вовлечен в регуляцию транскрипции [13].

Кроме того, CpG островок гена RNF145 (RING FINGER PROTEIN 145) имел достоверные различия в уровне метилирования в обеих группах как до, так и после диеты, однако функция этого гена неизвестна [13].

В то же время некоторые из генов EWAS не показали различий в уровне метилирования в нашем исследовании, хотя недавно была показана достоверная связь этих генов с ожирением: Pbx1 (PRE-B-CELL фактор транскрипции лейкоза), участвующий в развитии и функционировании поджелудочной железы, кандидат SNP, связанных с ожирением [13]; VPS25 (VACUOLAR PROTEIN-SORTING-ASSOCIATED PROTEIN 25) — часть ESCRT-II комплекса, участвующего в эндосомном транспорте и, возможно, транскрипции генов [13]; WT1 (Wilms tumor 1), кодирующий белок Kruppel-like zinc-finger, который ведет себя как транскрипционный фактор, действующий и как супрессор опухоли, и как онкоген в зависимости от типа клеток, в которых он экспрессируется [15, 17]; HIF3A (HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR 3, ALPHA SUBUNIT) — компонент индуцируемого гипоксией фактора транскрипции (HIF), который регулирует широкий спектр клеточных и физиологических реакций на снижение концентрации кислорода путем регулирования экспрессии многих генов-мишеней [18]; PHGDH (PHOSPHOGLYCERATE DEHYDROGENASE), кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу — фермент, который катализирует первый шаг в пути фосфорилирования биосинтеза серина [19]; ATP10A (AMINOPHOSPHOLIPID TRANSLOCASE), кодирующий аминофосфолипид-транслоказу, которая переносит фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин с одной стороны бислоя к другой [15, 16]. Это тип IV Р-типа АТФ-азы, связанной с липидным обменом, и вероятно, участвует в модуляции жира [15, 24].

На фоне вмешательства в группе со снижением массы тела были выявлены изменения уровня метилирования CpG островков генов PRR5L и C7orf50 (повышения уровня метилирования) и генов KDM2B (LYSINE K-SPECIFIC DEMETHYLASE 2B-H3K36-гистон деметилазы, вовлеченный в клеточное старение, дифференцировку опухолевых клеток, часть комплекса, который подавляет дифференцировку преадипоцитов) и C7orf50 (снижение уровня метилирования) [13]. В то же время в группе без динамики массы тела CpG генов изменения в уровне метилирования были получены только для гена C7orf50.

Таким образом, в нашей работе, во-первых, показаны различия между группами с различной динамикой ИМТ в исходном уровне метилирования 4 генов RNF145, PRR5L, C7orf50, ATP10A, которые могут обусловливать различный ответ на диету. А во-вторых, мы показали возможность изменения уровня метилирования генов, ассоциированных с ожирением на фоне диеты и снижения массы тела. После вмешательства достоверные различия между группами по уровню метилирования были получены в 10 из 19 генов: ZNF710, WT1, VPS25, RNF145, PHGDH, PBX1, KDM2B, HIF3A, C7orl50, ATP10A.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.М., И.С., Н.К., А.М.К., О.Т., С.Б.

Сбор и обработка материала — И.С., Н.К., О.И., А.М., А.К.

Статистическая обработка — Э.Х., А.Е.

Написание текста — А.М., А.В.К.

Редактирование — С.Б., Н.К.