Перспективы применения генной терапии при артериальной гипертонии

В настоящее время разрабатываются два различных подхода к генной терапии при артериальной гипертонии (АГ). Первый основан на внедрении копий генов, отвечающих за вазодилатацию, с использованием вирусов в качестве средства доставки нужной генетической информации (вирусов-проводников), второй — на использовании антисмысловых ДНК, подавляющих трансляцию или транскрипцию с генов, которые отвечают за продукцию вазоконстрикторов. Основные преимущества применения антисмысловых олигодезоксинуклеотидов (ОДН) заключаются в том, что их эффект проявляется через несколько часов после введения и зависит от применяемой дозы, а концентрация в плазме может быть измерена. Дать соответствующую характеристику вирусов-проводников крайне трудно. При внедрении генов, участвующих в синтезе калликреина, эндотелиальной NO-синтетазы, аденомедуллина и предсердного натрийуретического гормона, в клетки-мишени животных с различными видами экспериментальной АГ наблюдается вазодилатирующий эффект. Внедрение в гены, отвечающие за вазоконст рикцию, антисмысловых ДНК в комплексе с адено-ассоциированными вирусами (ААВ), применяемы ми в качестве вирусов-проводников, также оказалось эффективным при нескольких экспериментальных моделях АГ. Использование ретровирусов для доставки антисмыслового гена рецептора ангиотензина I типа (АТ₁-Р) ограничено, поскольку эти вирусы проникают только в делящиеся клетки. Дальнейшие исследования в данной области должны привести к разработке принципиально новых гипотензивных препаратов, практически лишенных побочных эффектов, с продолжительностью действия, которая исчисляется месяцами.

Очевидно, что до начала клинического использования методов генной терапии АГ необходимо решить технические проблемы, связанные с доставкой нужного генетического материала, выбором пути введения, определением биодоступности препаратов, их токсичности, клинической эффективности, а также с развитием иммунных реакций.

За несколько последних десятилетий были разработаны эффективные препараты для лечения АГ, каждый из которых воздействует на одно из звеньев в патогенезе этого состояния. Прежде всего, к ним относятся антагонисты b-адренергических рецепторов, рецепторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) и АТ₁-Р.

Совсем недавно пристальное внимание ученых привлекли методы воздействия на гены-мишени, отвечающие за продукцию белков организма, избыток или чрезмерная активность которых способны вызвать АГ. У читателя может возникнуть вопрос: зачем при наличии разнообразных эффективных препаратов для лечения АГ тратить огромные средства на создание и испытание еще одной группы лекарственных средств? Во-первых, современные гипотензивные препараты нужно принимать ежедневно, а подчас и несколько раз в день. Неудобство подобных схем лечения приводит к тому, что предписания врача часто нарушаются, а у 20—35% больных на фоне проводимой терапии сохраняется АГ [1]. Во-вторых, прием традиционных средств для лечения АГ нередко сопровождается развитием нежелательных побочных реакций. В-третьих, современные гипотензивные препараты представляют собой химические, чужеродные для человеческого организма вещества. Куда привлекательнее идея безопасного лекарственного средства с длительностью действия, достигающей одного года или даже больше.

В связи с многофакторным характером АГ ее генную терапию до недавнего времени считали невозможной. Действительно, выявлены лишь несколько генов, участвующих в развитии АГ. Однако оказалось, что в полной расшифровке всех генетических механизмов АГ нет необходимости. Достаточно воздействовать на гены, связанные с рецепторами, которые удается успешно блокировать при стандартной гипотензивной терапии.

Как уже отмечалось, разрабатываются два различных подхода к генной терапии при АГ. Первый подразумевает внедрение с помощью вирусов-проводников копий генов, отвечающих за вазодилатацию и торможение процессов гипертрофии в мышечном слое сосудистой стенки, второй — выключение генов, отвечающих за синтез вазоконстрикторов и факторов роста (см. таблицу). Так, у мышей выключение генов ренин-ангиотензиновой системы приводит к снижению АД [2], а выключение генов, ответственных за продукцию предсердного натрийуретического гормона и калликреина, напротив, способствует повышению АД [3]. У крыс внедрение генов ренина с параллель ным повышением концентрации его предшественников вызывает повышение АД [4, 5]. В составе плазмид внедряли гены, отвечающие за экспрессию предсердного натрийуретического гормона [6], эндотелиальной NO-синтетазы [7] и калликреина [8, 9]. В разных экспериментальных моделях АГ внутривенное введение фрагментов ДНК, содержащих гены эндотелиальной NO-синтетазы или калликреина, с использованием цитомегаловируса в качестве вируса-проводника приводило к снижению АД [7, 8], улучшению морфологической структуры почек и уменьшению массы сердца [10]. Подавление вазоконстрикции с помощью генетических воздействий (антисмысловое подавление) изучено значительно лучше, чем стимуляция вазодилатации, и применяется в клинике как альтернатива антагонистам ренин-ангиотензиновой системы. При таком подходе с помощью вирусов-проводников в кровь вводят антисмысловые ОДН или антисмысловую ДНК.

Первым методом генной терапии, использованным при лечении экспериментальной АГ, было внедрение антисмысловых ОДН для выключения информационной РНК (иРНК), которая отвечает за продукцию АТ₁-Р и ангиотензиногена. Антисмысловые ОДН представляют собой одиночную цепочку, состоящую из коротких нуклеотидных последовательностей, которые присоединяются к специфической иРНК и мешают ей считывать информацию на рибосомальном этапе синтеза белка. За счет этого подавляется трансляция или транскрипция и, следовательно, выработка специфических белков. Поскольку антисмысловой эффект сохраняется в течение длительного времени, такой препарат достаточно вводить один раз в неделю.

Осуществлено успешное внедрение антисмысловых ОДН в иРНК, ответственную за синтез ренина, АТ, АПФ и АТ₁-Р. Применение этих антисмысловых ОДН приводило к снижению АД в нескольких экспериментальных моделях АГ, включая генетическую (спонтанная АГ у крыс) [11—14], хирургическую (пережатие почечной артерии с одной стороны) [15] и стрессовую (холодовая АГ) [16]. Избирательно действующие антисмысловые олигомеры, которые были исследованы до настоящего времени, во всех случаях выключали гены-мишени с характерным биологическим эффектом. Через 3—9 ч после введения антисмысловых ОДН происходило снижение АД на 20—30 мм рт. ст., причем действие препарата наблюдалось в течение 7 (в среднем 3—4) сут [11]. Эти показатели превосходят соответствующие параметры всех известных гипотензивных средств. Нормальное АД можно поддерживать на протяжении длительного времени, вводя препарат повторно. Даже при многомесячном применении антисмысловых ОДН не было отмечено токсических реакций. При исходно неизмененном АД антисмысловые ОДН практически не влияют на его уровень. Скорее всего, это связано с тем, что антисмысловые ОДН подавляют лишь избыточную экспрессию генов ренин-ангиотензиновой системы, которая играет ключевую роль в патогенезе АГ. Антисмысловые ОДН не проникают через гематоэнцефалический барьер и плаценту, поэтому не оказывают воздействия на центральную нервную систему и плод. Последнее обстоятельство делает весьма заманчивым их применение при преэклампсии.

При внутривенном введении большая часть антисмысловых ОДН, подавляющих экспрессию гена АТ₁-Р, выявляется в кровеносных сосудах, почках и надпочечниках, где и располагается основная часть АТ₁-Р. Захват ОДН также высок в печени, поэтому целесообразно применять антисмысловые ОДН, подавляющие синтез ангиотензино гена (который в основном продуцируется именно в печени). Антисмысловые ОДН, подавляющие экспрессию гена АПФ, можно вводить с помощью аэрозоля в легкие, где в первую очередь проявляется действие этого фермента.

С завершением клинических испытаний III фазы, которые должны подтвердить низкую токсичность и высокий терапевтический индекс антисмысловых ОДН [17], начнется эра клинического применения этих препаратов. Остается разработать формы антисмысловых ОДН для приема внутрь.

Антисмысловые олигонуклеотиды успешно применяются и в чистом виде, однако их эффективность при внутривенном введении повышается, если в качестве средств доставки использовать катионные липосомальные носители или асиалогликопротеин. Увеличить продолжительность антисмыслового подавления можно, доставляя антисмысловую информацию к генам-мишеням посредством вирусов-проводников.

Для внедрения антисмысловой ДНК используются ретровирусы, аденовирусы и ААВ. Каждый из них имеет свои достоинства, но ни один не соответствует требованиям, которые предъявляют к так называемому идеальному вирусу-проводнику [18, 19].

Идеальный вирус-проводник не должен вызывать заболеваний. В целях безопасности либо применяют непатогенные вирусы, либо изменяют структуру патогенных вирусов. Вирус-проводник не должен стимулировать иммунные или воспалительные реакции, хаотически внедряться в другие гены, тем самым вызывая неконтролируемые мутации. Следует использовать вирусы, лишенные способности к репликации, а значит, к распространению в других тканях или к смене хозяина. Кроме того, вирус-проводник должен в достаточном количестве попадать в клетки, которые содержат гены-мишени. В техническом отношении вирус-проводник должен иметь простое строение и легко выделяться в чистом виде, а также присоединять трансген и промотор; рекомбинантный вирус-проводник должен иметь высокий титр; рекомбинантная ДНК должна быть надежно "упакована" в белки вириона.

В экспериментах ретровирусы применялись, прежде всего, в связи с их способностью доставлять трансгены в делящиеся клетки, внедрять и обеспечивать стабильную интеграцию единичных копий генов. Ретровирусы эффективны в культурах клеток, но имеют обыкновение беспорядочно внедряться в геном, что вызывает определенные сомнения в возможности их клинического применения. Воздействие на делящиеся клетки делает ретровирус идеальным вирусом-проводником при генной терапии злокачественных опухолей, но требует защиты других обновляемых тканей организма и практически исключает использование этих вирусов для лечении АГ у взрослых (за исключением сочетаний АГ с кардиомиопатией, рестенозом коронарных артерий, отрицательным ремоделированием коронарных и легочной артерий).

Аденовирус представляет собой двойную цепочку ДНК и способен проникать почти в любые клетки млекопитающих, поскольку большинство этих клеток имеют мембранные рецепторы. Вирус вступает во взаимодействие с рецептором, за счет эндоцитоза проникает внутрь клетки и перемещается к ядру. Большинство вирусов-проводников на основе аденовирусов, применяющихся в настоящее время, не внедряются в ДНК клеток хозяина и поэтому, несмотря на высокий уровень экспрессии, быстро теряют активность. У животных с небольшой продолжительностью жизни, например у мышей, продолжительность действия аденовирусного проводника относительно велика, но у людей ее нельзя назвать достаточной. Поскольку гены аденовирусов участвуют в синтезе тысяч белков, при использовании такого проводника повышается активность иммунной системы, происходит стимуляция сосудистого воспаления. Повторные введения аденовируса неизбежно приводят к повреждению тканей [20]. Эта особенность делает рекомбинантные аденовирусы, разработанные к настоящему времени, неприемлемыми для длительной генной терапии у людей, что подтверждается результатами нескольких клинических испытаний. Дальнейшее совершенствование структуры рекомбинантного аденовируса может привести к устранению этих недостатков.

Таблица . Методы генной терапии при артериальной гипертонии

ААВ относятся к группе парвовирусов и загрязняют микробиологические культуры аденовирусов. Они относятся к непатогенным вирусам и чаще других используются для доставки антисмысловой информации к генам АТ₁-Р при моделировании АГ у крыс [21]. Репликация ААВ происходит только в присутствии вирусов-хелперов (аденовирусы и плазмиды, содержащие гены rep и cap).

Другим преимуществом ААВ является небольшая длина ДНК, необходимая для доставки трансгена. Таким образом, вирус-проводник может нести антисмысловую ДНК, а управление ДНК и геном-репортером (например, геном устойчивости к неомицину) осуществляется с помощью активного промотора, тесно переплетающегося с промотором соответствующей тирозинкиназы.

В отсутствие вируса-хелпера и носителя генетической информации, ответственной за репликацию ААВ, рекомбинантные ААВ не способны распространяться в другие ткани организма или сменить хозяина. Удаляя вирусные кодирующие последовательности, можно предотвратить иммунные ответные реакции на экспрессию вирусного гена и, следователь но, развитие воспаления. ААВ сохраняются в течение длительного времени. Так, экспрессию антисмысловой ДНК рекомбинантного ААВ в гладких мышцах сосудов выявляли более чем через 9 нед, а в головном мозге — более чем через 11 мес после инъекции вируса [22].

К недостаткам ААВ относятся и сложности технологического характера, поскольку ААВ можно очистить и концентрировать, как и другие вирусы-проводники, но в отличие от последних их следует отделить от аденовирусов. Несмотря на это, ААВ обладают безусловными преимуществами, главным из которых следует считать безопасность. Отсутствие токсичности ААВ было продемонстрировано в ходе их клинических испытаний при муковисцидозе [21].

Кроме разных вирусов-носителей применялись также различные промоторы. Идеальный промотор должен в течение длительного времени сохранять активность, поддерживая экспрессию трансгена, и проявлять специфичность по отношению к определенному типу тканей, например клеткам сердца, почек или мышечной стенки сосудов. Изучаются тканевые промоторы рекомбинантных ААВ, способствующих подавлению синтеза ангиотензиногена в печени или экспрессии АТ₁-Р в гладких мышцах сосудов. При использовании методов генной терапии в клинике важно направить вирусы-проводники в определенные ткани и, управляя промоторами, иметь возможность "включать" и "выключать" гены. В частности, при лечении АГ могут возникать ситуации, когда необходимо быстрое прекращение гипотензивного эффекта.

Литература

1. Burt V.L., Whelton P., Roccella E.J., Brown C., Cutler J.A., Higgins M., et al. Prevalence of hypertension in the US adult population: results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey. Hypertension 1995;25:305—13.

2. Tanimto K., Sugiyama F., Goto Y., Ishida J., Takimoto E., Yagami K., et al. Angiotensinogen-deficient mice with hypotension. J Biol Chem 1994;269:31334—7.

3. Kim H.S., Krege J.H., Kluckman K.D., Hagaman J.R., Hodgin J.B., Best C.F., et al. Genetic control of blood pressure and the angiotensinogen locus. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:2735—9.

4. Schinke M., Bohm M., Bricca G., Ganten D., Bader M. Permanent inhibition of angiotensinogen synthesis of antisense RNA expression. Hypertension 1996;27:508—13.

5. Smythies O. A mouse view of hypertension. Hypertension 1997;30:1318—24.

6. Lin K.F., Chao J., Chao L. Human atrial natriuretic peptide gene delivery reduced blood pressure in hypertensive rats. Hypertension 1995;26:847—53.

7. Lin K.F., Chao L., Chao J. Prolonged reduction of high blood pressure with human nitric oxide synthase gene delivery. Hypertension 1997;30(pt 1):307—13.

8. Wang C., Chao L., Chao J. Direct gene delivery of human tissue kallikrein reduces blood pressure in spontaneously hypertensive rats. J Clin Invest 1995;1710—6.

9. Yayama K., Wang C., Chao L., Chao J. Kallikrein gene delivery attenuates hypertension and cardiac hypertrophy and enhances renal function in Goldblatt hypertensive rats. Hypertension 1998;31:1104—10.

10. Chao J., Zhang J.J., Lin K.-F., Cho L. Human kallikrein gene delivery attenuates hypertension, cardiac hypertrophy, and renal injury in Dahl salt-sensitive rats. Hum Gene Ther 1998;9: 21—31.

11. Gyurko T., Tran D., Phillips M.I. Time course of inhibition of hypertension by antisense oligonucleotides targeted to AT₁ angiotensin receptor mRNA in spontaneously hypertensive rats. Am J Hypertens 1997;10:56S—62S.

12. Tomita N., Morishita R., Higaki J., Aoki M., Nakamura Y., Mikami H., et al. Transient decrease in high blood pressure by in vivo transfer of antisense oligodeoxynucleotides against rat angiotensinogen. Hypertension 1995;26:131—6.

13. Wielbo D., Simon A., Phillips M.I., Toffolo S. Inhibition of hypertensin by peripheral administration of antisense oligodeoxynucleotides. Hypertension 1996;28:147—51.

14. Makino N., Sugano M., Ohtsuka S., Sawada S. Intravenous injection with antisense oligodeoxynucleotides against angiotensinogen decreases blood pressure in spontaneously hypertensive rats. Hypertension 1998;31:1166—70.

15. Galli S.M., Varela A., Phillips M.I. Lowering of blood pressure and catecholamines in chronic but not in acute 2 kidney-1 clip rats by antisense oligodeoxynucleotide to angiotensin rnRNA. Hypertension 1995;26:557. Abstract.

16. Peng J.-F., Kimura B., Fregly M., Phillips M.I. Reduction of cold-induced hypertension by antisense oligodeoxynucleotides to angiotensinogen mRNA and AT₁ receptor mRNA in brain and blood. Hypertension 1998;31:1317—23.

17. Crooke S.T. Antisense therapeutics. In: Cuello A.C., Collier B., eds. Pharmacological Sciences: Perspectives for Research and Therapy in the Late 1990. Basel, Switzerland: Birkhauser Verlag; 1995.

18. Crystal R.G. Transfer of genes to humans: early lesson and obstacles to success. Science 1995;270:404—10.

19. Leiden J.M. Gene therapy: promise, pitfalls and prognosis. N Engl J Med 1995;333:1204—7.

20. Tripathy S.K., Black H.B., Goldwasser E., Leiden J.M. Immune responses to transgene-encoded proteins limit the stability of gene expression after injection of replication-defective adenovirus vectors. Nat Med 1996;2:545—50.

21. Flotte T.R., Carter B., Conrad C., Guggino W., Reynolds T., Rosenstein B., Taylor G., Walden S., Wetzel R. A phase I study of an adeno-associated virus-CTFR gene vector in adult CF patients with mild lung disease. Hum Gene Ther 1996;7:1145—59.

22. Mohuczy D., Wang S., Klein R.L., Meyers C., Hughes J.A., Phillips M.I., et al. Pharmacokinetic evaluation of AAV-mediated gene transfer into the brain. Soc Neurosci 1998;24:1287. Abstract.

Возврат к содержанию| Возврат на home page "Международного журнала медицинской практики"| Возврат на home page издательства "МедиаСфера"