Кальпаин и его роль в процессах нейродегенерации

Кальпаины (ЕС 3.4.22.17) относятся к семейству цитозольных Ca²⁺-активируемых внутриклеточных цистеиновых протеаз [1, 2]. У млекопитающих идентифицированы тканеспецифичные (n-кальпаины) и универсальные кальпаины, из которых наиболее хорошо изучены и охарактеризованы две изоформы — микро-кальпаин (µ- или кальпаин 1, CAPN1) и милли-кальпаин (m- или кальпаин 2, CAPN2), которые активируются при низких (2—80 µM) и высоких (0,2—0,8 мМ) концентрациях внутриклеточного кальция (вк[Ca²⁺]) соответственно. Активный кальпаин вовлекается в клеточные сигнальные механизмы, строго регулируемые вк[Ca²⁺]. Каждая молекула µ- и m-кальпаина состоит из каталитической (80 кДа) и регуляторной (30 кДа) субъединицы, C-концы которых представлены кальмодулинподобными Ca²⁺-связывающими доменами. В процессе активации кальпаина происходит его связывание с мембранами, которое обеспечивает глицинсодержащий N-концевой домен регуляторной субъединицы. При относительно низких концентрациях вк[Ca²⁺] (50—100 нМ) кальпаин содержится в цитозоле в виде профермента, который с повышением in vivo уровня свободного Ca²⁺ диссоциируется на активные субъединицы (78 кДа, 18 кДа), имеющие облегченный доступ к своим цитозольным и мембранно-ассоциированным субстратам [3].

В физиологических условиях кальпаин осуществляет ограниченный протеолиз белков, что приводит к модификации и изменению биологической активности субстратов. Этим объясняется биомодулирующая роль кальпаина в процессах клеточной миграции, ремоделировании и сохранении структурной целостности цитоскелета, дифференциации клеток [3]. В некоторых случаях субстратные белки полностью разлагаются под действием кальпаина. Путем протеолиза внутриклеточных субстратов, включая рецепторы, киназы, фосфатазы, белки синаптосом, кальпаин вовлекается в сигнальные пути нейрохимических процессов, регулируя синтез, высвобождение и обратный захват нейротрансмиттеров [4].

Патогенетическая роль кальпаина установлена при заболеваниях нервной системы, таких как ишемическая болезнь мозга [5], травмы головного [6, 7] и спинного мозга [8, 9], нейродегенеративные заболевания, включая болезни Альцгеймера (БА), Паркинсона (БП) и Гентингтона (БГ) [10, 11], боковой амиотрофический склероз (БАС), демиелинизирующие заболевания [12—14], экспериментальный оптический неврит [15], катаракта [16], спиноцеребеллярная атаксия 17-го типа [17]. Субстраты кальпаина, участвующие в процессах нейродегенерации, приведены в табл. 1.

Таблица 1. Ключевые субстраты кальпаина при нейродегенерации

Примечание. CaMKIIα — Ca²⁺/кальмодулинзависимая протеинкиназа IIα; CaMKIV — Ca²⁺/кальмодулинзависимая протеинкиназа IV; CaN — кальцинейрин A; IP3R — инозитол (1,4,5)-трифосфатный рецептор; PKC — протеинкиназа C; SERCA — кальциевая АТФаза сарко/эндоплазматического ретикулума; белки, MAP, MAP1, MAP2 — ассоциированные с микротрубочками белки; AIF — апоптозиндуцирующий фактор; MBP — основной белок миелина; NFP — аксональный нейрофибриллярный белок; GSK-3β — гликогенсинтаза киназа 3β; IP3 Kinase B — инозитол-1,4,5-трифосфаткиназа B; nNOS — нейрональная синтаза оксида азота; PLCβ — фосфолипаза Cβ), PKA — протеинкиназа A; GluR1 — рецептор глутамата 1; mGluR1α — метаботропный рецептор глутамата 1α;, NMDA NR2A и NMDA NR2B — субъединицы NR2A рецепторов N-метил-D-аспартата; NCAM — адгезивная молекула нервных клеток; APP — амилоидный прекурсор протеин; IkBα — ядерный фактор энхансера гена легкого полипептида каппа в ингибиторе B-клеток, альфа; РС — рассеянный склероз; ТПМ — травматическое повреждение мозга.

Протеолиз внутриклеточных субстратов под действием активного кальпаина приводит к нарушению структурной целостности и функциональной активности нейронов. Особо следует отметить прототипический субстрат кальпаина альфа-спектрин, расщепление и образование продуктов распада которого рассматривают в качестве биомаркеров протеолитического разрушения нервных клеток [21]. При патологических состояниях бесконтрольная активация кальпаина в сопряжении с другими протеазами ведет к распаду спектрина, фрагментации ДНК и программированной гибели клеток [3]. Активация кальпаинового пути деградации структурных белков нейронов наблюдается при экспериментальной ишемии головного мозга (ИМ) [22], травмах головного [23] и спинного [8] мозга, демиелинизирующих заболеваниях [13]. Повышенная активность кальпаина и истощение кальпастатина — эндогенного ингибитора кальпаина, отмечаются в мозге больных БА, чем, возможно, объясняется высокий уровень протеолитических фрагментов спектрина в цереброспинальной жидкости [24]. Расщепление кальпаином белка-медиатора коллапсинового ответа 2 (CRMP2), предупреждающего фрагментацию проксимальных отделов аксонов, ведет к острой аксональной дегенерации оптического нерва (in vivo, in vitro) [25].

Активация кальпаина происходит в условиях митохондриальной дисфункции, оксидативного стресса, нарушения баланса и повышения уровня вк[Ca²⁺] [26]. Эти состояния могут быть вызваны в экспериментальных моделях БП (in vivo, in vitro) с использованием паркинсонических нейротоксинов — ингибиторов митохондриальной НАД∙Н₂^_дегидрогеназы (комплекс I), 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП, МФП⁺) и ротенона. Индуцированный действием нейротоксинов рост вк[Ca²⁺], экспрессия активного кальпаина и активация эффекторных протеаз (например, каспаза-3) стимулируют индукторы апоптоза, такие как cdk5, p35, p53, Bad, Bax, tBid, Bak, PARP-1. На экспериментальных моделях БП показано, что активация кальпаина и проапоптотических молекул ведет к вырождению и гибели дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС), а также экстранигральных дорсальных нейронов и вентральных мотонейронов спинного мозга [27—31]. Активация кальпаинового пути в условиях дисбаланса вк[Ca²⁺] приводит к формированию цитотоксических включений, характерных для нейродегенеративных заболеваний. Например, гиперактивация кальпаина способствует образованию агрегатов бета-амилоида и гиперфосфорилированию тау-белка, накоплению амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков, специфичных для патогенеза БА [32, 33]. В нейропатологии БП знаковое значение имеют цитотоксические тельца Леви, состоящие в основном из агрегатов альфа-синуклеина. Расщепление альфа-синуклеина активным кальпаином 1 с образованием высокомолекулярных цепей является триггером формирования телец Леви — биомаркеров поврежденных дофаминергических нейронов ЧС [34—36]. В патогенезе БА и БП кальпаин вызвыает интерес с точки зрения потенциации нейровоспалительного ответа путем активации и миграции резидентных и периферических медиаторов воспаления (астроциты, микроглия, T-клетки, макрофаги) [37, 38].

В процессе апоптоза кальпаин может регулироваться субстратами, которые непосредственно участвуют в процессах деградации клеток; это белки митохондриальных мембран (Bax, Bcl-2), рецепторные (инозитолтрифосфат IP₃), кальмодулин-связывающие (G протеины, кальцинейрин), ассоциированные с миелином, белки цитоскелета (альфа-спектрин, актин, ассоциированный с микротрубочками протеин 2, нейрофиламенты), тау-протеин, альфа-синуклеин, апоптоз-индуцирующий фактор (AIF), ферменты сигнальной трансдукции (фосфолипаза C, протеинкиназа C, протеинфосфатаза IIb), факторы транскрипции (c-Fos, c-Jun) и ряд других структурных сигнальных и цитозольных белков [11].

Участие кальпаина в апоптозе клеток сопряжено с активацией каспаз — инициаторных (каспазы-8, -9, -10) и эффекторных (каспазы-1, -3, -6, -7). Считается, что главным эффектором в финальной стадии апоптоза является каспаза-3, которая расщепляет репаративный фермент ядерной ДНК — поли(АДФ-рибоза)-полимеразу 1 (PARP-1) [39]. Расщепление клеточного комплексного субстрата ICAD-CAD (каспазой активируемой ДНКазы 1) способствует деградации нуклеосомальной ДНК при апоптозе [40]. На ранних стадиях апоптоза возможна перекрестная протеолитическая активация кальпаина и каспазы-3. При расщеплении про-каспазы-3 образуются активные субъединицы каспазы-3, которые в свою очередь протеолизируют и инактивируют эндогенный ингибитор кальпаина — кальпастатин, что приводит к длительной активации кальпаина [41]. Замечено, что сопряженная активация двух протеаз кальпаина и каспазы-3 потенцирует действие кальпаина при БП [42].

Ингибирование кальпаина

Роль кальпаина в нейропатофизиологических процессах указывает на целесообразность разработки и изучения потенциальных синтетических ингибиторов кальпаина с целью предотвращения и/или замедления процессов нейродегенерации [43, 44]. Специфическим эндогенным регулятором и ингибитором протеолитической активности µ- и m-кальпаина в клетках млекопитающих является кальпастатин (CAST) [18, 45]. В условиях длительной активации кальпаина протеолитическая инактивация кальпастатина и снижение его ингибирующей способности приводят к росту протеолиза субстратов кальпаина. Например, при экспериментальной травме головного мозга у кальпастатин-экспрессирующих трансгенных мышей существенное ограничение протеолиза субстратов кальпаина нормализует поведенческие расстройства [6]. Исследование мозга больных БА показало падение уровня кальпастатина и активацию кальпаина [46]. Потенциальные ингибиторы кальпаина при БА нацелены главным образом на восстановление функциональных нарушений памяти, синаптической активности, вызванных избытком амилоида-β. Исследования показали благоприятный эффект селективных ингибиторов кальпаина 1, таких как NYC438 и NYC488, предлагаемых в качестве возможных функциональных и терапевтических средств [47].

В условиях повышенной экспрессии кальпастатина или под действием синтетического ингибитора кальпаина MDL-28170 наблюдаются нейропротективный эффект в популяции дофаминергических нейронов головного мозга и замедление развития нейрофизиологических отклонениий у мышей после введения МФТП [48]. Ввиду большой молекулярной массы (110 кДа) кальпастатин не проникает через клеточные мембраны и поэтому не рассматривается в качестве потенциального ингибитора кальпаина в терапевтических целях. Перспективным считается открытие и изучение новых аналогов кальпастатина, способных проникать через гематоэнцефалический барьер [49].

Исследования на нейротоксических (МФТП, МФП⁺, ротенон) моделях БП показали нейропротективный эффект синтетических ингибиторов кальпаина — кальпептина, SNJ1945 и SJA-6017. Например, в МФТП-индуцированной in vivo модели кальпептин предотвращает процессы нейродегенерации и активацию астроцитов (астроглиоз), микроглии (микроглиоз) и T-клеток в ЧС и популяциях дорсальных нейронов и вентральных мотонейронов спинного мозга C57BL/6N мышей [31, 50]. In vitro кальпептин, SJA-6017 и SNJ1945 повышают жизнеспособность и предупреждают апоптоз VSC 4.1 мотонейронов спинного мозга и дифференцированных SH-SH5Y клеток [27, 29, 51].

Кальцинейрин и его роль в процессах нейродегенерации

Кальцинейрин (протеинфосфатаза 2B, PP2B), единственная Ca²⁺/кальмодулин (Ca²⁺/CaM)-зависимая серин-треонин протеинфосфатаза, экспрессируется в большинстве тканей млекопитающих, однако обнаруживается в особенно высоких количествах в головном мозге (полосатое тело, гиппокамп, миндалина, неокортекс) [52]. Гетеродимерная молекула кальцинейрина состоит из 2 субъединиц — каталитической A (CNA, 61 кДа) и регуляторной B (CNB, 19 кДа). Субъединица CNA содержит CaM-связывающий участок и C-концевой домен, выполняющий роль аутоингибитора, а CNB представляет Ca²⁺-связывающий компонент. Взаимодействие кальцинейрина и Ca²⁺ в нервных клетках осуществляется через Ca²⁺-связывающий белок CaM. В условиях повышенного цитоплазматического уровня Ca²⁺ связывание CaM и регуляторной CNB с различными участками CNA приводит к полной активации фермента. При физиологических концентрациях вк[Ca²⁺] активность кальцинейрина регулируется аутоингибиторным доменом [53, 54]. Помимо активации Ca²⁺/CaM комплексом, кальцинейрин активируется двумя необратимыми внутримолекулярными протеолитическими, реализуемыми каспазой-3 и кальпаином [55, 56]. Несмотря на то что в интактных клетках кальцинейрин локализуется преимущественно в цитоплазме, при повышении концентрации вк[Ca²⁺] часть фермента может транслоцироваться в ядро и взаимодействовать с субстратами-мишенями [57].

Нейробиологическая роль кальцинейрина обусловлена преимущественно нейрональной локализацией фермента. Путем дефосфорилирования субстратов — молекулярных компонентов нейрональных сигнальных путей, кальцинейрин участвует в регуляции функциональной активности нервной системы [53, 58]. Это процессы синаптической пластичности и синаптогенеза, синаптической трансмиссии, высвобождения нейромедиаторов, нейропептидов и нейрогормонов функциональной модуляции рецепторов и ионных каналов, апоптоза и регуляции экспрессии генов [59—63].

Нейрорегуляция осуществляется при взаимодействии кальцинейрина с метаболическими партнерами — это Ca²⁺/CaM-зависимые протеинкиназы (CaMK II, CaMK IV), протеинкиназы A (PKA) и C (PKC), MAPK, гликогенсинтаза киназа-3 (GSK-3), казеинкиназы (CKI, CKII), рецептор IP3R [59, 64—66]. Регуляторы экспрессии CaM в нейронах — фосфопротеины нейрогранин (RC3) и нейромодулин (GAP-43), также являются субстратами кальцинейрина [67]. Субстраты кальцинейрина, участвующие в процессах нейродегенерации, приведены в табл. 2.

Таблица 2. Ключевые субстраты кальцинейрина при нейродегенерации

Примечание. ASK1 — киназа, регулирующая сигнал к апоптозу, тип 1; DRP1 — связанный с динамином белок 1; ERα — рецептор эстрогена альфа; GluA1 — A1 субъединица AMPA рецептора глутамата; MAP2 — ассоциированный с микротрубочками белок; NFATc — ядерный фактор активированных T-клеток; TFEB — транскрипционный фактор EB; MEF2 — фактор энхансера миоцитов-2; DAXX — белок, ассоциированный с доменом Death.

Научные данные указывают на двойственный функциональный характер кальцинейрина в нервной ткани. При патологии активация кальцинейрина может привести к морфофункциональным изменениям — потере синапсов, атрофии дендритов и синаптической дисфункции [69]. В зависимости от специфичности и длительности взаимодействия с Ca²⁺ и CaM кальцинейрин проявляет антагонистический эффект на ионные каналы, рецепторы нейромедиаторов, ферменты и транскрипционные факторы [66]. Нейропротективная роль кальцинейрина проявляется в условиях активации транскрипционного фактора MEF2 (myocyte-specific enhancer factor 2A) [70], тогда как дефосфорилирование кальцинейрином проапоптотического фактора Bad (Bcl2 associated cell death promoter) способствует апотозу [71].

Кальцинейрин вовлечен в процессы аутофагии в нейронах, тем самым участвуя в предупреждении патологической агрегации белков при нейродегенеративных заболеваниях. Например, быстрое увеличение мембранной проницаемости лизосом под действием природного соединения трегалозы коррелирует с ростом активности кальцинейрина, дефосфорилирования транскрипционного фактора TFEB (регулятор лизосомального биогенеза и аутофагии) и ядерной транслокации [72]. На дрожжевой модели БП показано, что кальцинейрин участвует во внутриклеточной транспортировке катепсина D в лизосомы, где происходят эндосомальная сортировка и расщепление аномальных белков [73].

Синаптическая дерегуляция Ca²⁺/CaM и кальцинейрина играет решающую роль в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний, таких как БА и БП. Установлена роль CaMK II и кальцинейрина в смещении баланса между явлениями долговременной потенциации и депрессии [74, 75]. Ранние исследования японских ученых показали, что топографическое распределение кальцинейрин-иммунореактивности в мозге больных (post mortem) с экстрапирамидными расстройствами и нигростриатными поражениями (БП, БГ) позволяет обнаружить повреждение базальных ганглиев [76].

Исследования на трансгенных моделях БП у мышей указывают на ключевую роль кальцинейрина в регуляции процессов фосфо- и дефосфорилирования синаптических белков-коннекторов (динамин, синапсины, амфифизины) и влияния этих изменений на отложение синуклеина в пресинаптических терминалях [77]. У α-синуклеин-мутагенных мышей (A53T) рост фосфатазной активности кальцинейрина и транслокация NFAT (nuclear factor of activated T cells) ведут к нейродегенерации дофаминергических нейронов, однако процесс предотвращается при ингибировании кальцинейрина циклоспорином A (CsA) [78].

Кальцинейрин и нейровоспаление

Кальцинейрин является ключевым ферментом в формировании воспалительного ответа путем активации T-клеток и генерации цитокинов, включая IL-2, -6, -4, -5, TNF-α [54, 58, 79]. Несмотря на незначительную экспрессию в глии [80], кальцинейрин участвует в образовании цитокинов в иммунной системе (астроциты, микроглия, макрофаги) [81—83].

Путем иммуномодуляции и активации нейровоспалительных медиаторов кальцинейрин может воздействовать на жизненно важные нейрофизиологические функции, в частности при старении, нейротравмах и заболеваниях с нейровоспалительным компонентом, таких как БА, БП, БГ, БАС, РС [84]. Наличие кальцинейрина в астроцитах гиппокампа старых β-амилоиднесущих трансгенных мышей и в гиппокампе человека на ранних стадиях снижения когнитивных функций предполагает функциональную связь между астроцитарной экспрессией кальцинейрина и деменцией на поздних стадиях заболевания [85]. Более того, астроцитарная иммунолокализация протеолитически образующихся активных фрагментов кальцинейрина (45—48 кДа, ΔCN-A48) указывает на центральную роль кальцинейрина в нейрональной дисфункции и нейродегенерации [86]. Формирование кальцинейрин-опосредованного нейровоспалительного фенотипа астроцитов связано с активацией внутриклеточных сигнальных путей и/или транскрипционных факторов (NFAT, NFκB, AP1, FOXO3) [84]. Последовательное связывание кальцинейрина с регуляторной субъединицей NFAT, его дефосфорилирование, ядерная транслокация и связывание с ДНК играют регулирующую роль в экспрессии генов различных биологически активных белков, в генерации цитокинов, таких как TNF-α, IL-2, IL-4, что приводит к активации астроцитов [79, 87]. Ввиду двойственной функциональной активности в астроцитах кальцинейрин может включаться как в активацию провоспалительных каскадов в ответ на TNF-α, так и в купирование тех же сигналов во взаимодействии с трофическим IGF-1 фактором [88].

Ингибирование кальцинейрина

Активность кальцинейрина регулируется эндогенными и экзогенными ингибиторами. В клинических и лабораторных исследованиях применяются природные, экзогенные ингибиторы кальцинейрина CsA и такролимус (FK506), обладающие иммуномодулирующими свойствами [89]. Оба соединения подавляют активность кальцинейрина образуя комплекс с соответствующим иммунофилином (CsA-циклофилин A и FK506-FKBP12). К эндогенным ингибиторам кальцинейрина относятся Cabin 1, AKAP79 (A-киназа, связывающийся белок), FK506-связывающий белок 38 (FKBP38), калсарцин и др. [89].

Результаты ряда исследований свидетельствуют об эффективном нейропротективном действии CsA и FK506, что особенно важно в случае нейродегенеративных заболеваний. Например, FK506 существенно снижает аккумуляцию окисленного дофамина в DJ-1 мутантных нейронах in vitro [90], блокирует потерю дендритных шипов в культуре Aβ₄₂-обработанных клеток [91], подавляет ротенон-индуцированную активацию апоптотического Bad фактора in vitro [92]. FK506 и CsA предотвращают фрагментацию митохондрий и дефосфорилирование Drp1(Ser637) in vitro [93]. Противовоспалительный эффект FK506 установлен на in vivo МФТП модели БП у мышей с провоспалительным компонентом (human-CD34⁺ мыши) [94].

В качестве ингибиторов интерес представляют геморфины — пептиды, образующиеся в физиологических условиях из β-цепи гемоглобина крови, обладающие способностью регулировать активность кальцинейрина. Показано, что геморфины модулируют активность кальцинейрина мозга и лимфоцитов путем связывания с CaM, демонстрируя при этом разнонаправленные дозозависимые эффекты [95, 96].

Взаимосвязь кальпаина и кальцинейрина при нейродегенерации

Интенсивное взаимодействие между кальпаином и кальцинейрином отчетливо прослеживается в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, таких как БА, БП, РС, БАС. Критическим фактором развития нейродегенеративных процессов различной этиологии является дизрегуляция накопления кальция [97]. Падение нейрофункциональной активности, вырождение и гибель селективных популяций нейронов коррелируют с Ca²⁺-индуцированной активацией кальпаина и кальцинейрина, что подтверждает метаболическую кросс-коммуникацию между этими ферментами [98]. В условиях дисбаланса вк[Ca²⁺] кальпаин связывается и протеолитически расщепляет каталитическую субъединицу кальцинейрина CN-A (60 kDa) на несколько высокоактивных фрагментов (45—48 кДа, ΔCN-Aα48), лишенных C-концевого аутоингибирующего домена, ответственного за лимитацию активности кальцинейрина при низких уровнях Ca²⁺/CaM (in vitro, in vivo) [56]. В культуре Jurkat клеток, обработанных Ca²⁺ ионофором, расщепление кальпаином 1 C-концевого cain/cabin1 домена кальцинейрина также усиливает апоптоз клеток [99].

Взаимодействие кальпаина и кальцинейрина наблюдается при нейрофибриллярной дегенерации и тау-патологии, характерной для БА [32]. Сравнительно высокий уровень активного кальпаина 1 в неокортексе больных БА (post mortem) наряду с активацией кальцинейрина коррелирует с количеством нейрофибриллярных клубков (но не β-амилоидных бляшек), состоящих из аномально гиперфосфорилированных агрегатов тау-белка. Существенный рост активности кальпаина и образование активных фрагментов кальцинейрина (ΔCN-Aα48) в первичной культуре клеток гиппокампа, обработанных олигомерными Aβ(1-42), указывают на взаимодействие этих ферментов на ранних стадиях снижения когнитивных функций при БА [100].

Заключение

Многокомпонентные нейродегенеративные процессы включают разнообразие сигнальных путей, ведущих к вырождению и гибели селективных популяций клеток, в зависимости от нейропатологии. Общим в этих процессах является взаимосвязанная активация кальпаина и кальцинейрина, которые в определенных условиях (митохондриальная дисфункция, оксидативный стресс, стресс, аберрантный кальций) могут играть решающую роль в гибели клеток. Ингибирование кальпаина при патологии нервной системы нацелено на предупреждение активации его субстратов, компонентов сигнальных путей, а также на предотвращение распада белка цитоскелета — спектрина.

Ингибиторы кальцинейрина, обладающие иммуномодулирующим действием (CsA, FK506), также проявляют нейропротективный эффект. Поэтому ингибиторы кальпаина и/или кальцинейрина заслуживают более пристального внимания в качестве потенциальных терапевтических средств. Для достижения положительных клинических результатов фармакотерапия может основываться либо на комбинировании средств, либо на одном препарате с множественным действием. В перспективе поиск и фармакологическое моделирование нейропротективных средств рекомендуется проводить с учетом воздействия на Ca²⁺-регулируемые ферменты — кальпаин и кальцинейрин, на уровне экспрессии и активности, а также влияния на метаболические компоненты и/или субстраты, регулируемые этими ферментами.

Работа выполнена в рамках гранта ANSEF-2022 (Yervant Terzian Armenian National Science and Education Fund based in New York, USA).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.