Увеличение информативности молекулярно-генетических маркеров и в конечном счете повышение эффективности молекулярно-генетических идентификационных исследований - актуальная проблема современной судебной биологии. Ее углубленная разработка и реализация в этой сфере новых методических решений способны существенно повысить уровень доказательного значения экспертных результатов.

Одним из перспективных подходов к решению этой задачи представляется внедрение новых, более информативных аналитических методов в уже используемые «традиционные» технологические схемы. Так, например, для анализа широко распространенных молекулярно-генетических маркеров ПДАФ-типа (локусы коротких тандемных повторов хромосомной ДНК или STR-маркеров) в принципе могут быть применены альтернативные методики генотипирования, которые наряду с полиморфизмом длины позволяют детектировать еще и полиморфизм нуклеотидной последовательности ДНК-маркеров, поскольку именно в этом видится ресурс для увеличения дискриминирующего потенциала STR-маркеров. За последние несколько лет в этом направлении были развернуты целевые исследования [1].

Цель работы - изучение феномена полиморфизма нуклеотидной последовательности в аллелях STR-локусов хромосомной ДНК человека и обусловленных этим феноменом различий в одноименных STR-аллелях. Этой тематике посвящен ряд наших ранее опубликованных работ [2-4], в которых изучали характер и уровень индивидуальных различий одноименных STR-аллелей по признаку присутствия или отсутствия в них точковых нуклеотидных замен (single nucleotide polymorphism - SNP) в аспекте возможного повышения информативности судебно-экспертного генотипирования STR-локусов за счет выявления в их аллелях SNP и расширения таким образом их аллельного спектра.

Эти исследования показали, что полиморфизм нуклеотидной последовательности ДНК действительно можно рассматривать как потенциально значимый источник увеличения дискриминирующего потенциала STR-маркеров. Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности ДНК для генотипирования маркеров ПДАФ-типа хромосомной ДНК способен обеспечить заметное повышение эффективности их использования в качестве индивидуализирующих маркеров при выполнении молекулярно-генетических экспертиз [5].

В развитии этого направления отдельный интерес представляет изучение феномена полиморфизма нуклеотидной последовательности в аллелях STR-локусов хромосомной ДНК человека в популяционном аспекте. Тема популяционно-специфических признаков ДНК весьма актуальна. В настоящее время в мире активно ведется поиск молекулярно-генетических маркеров, которые были бы способны выступать в качестве эффективного инструмента дифференцирования популяционной принадлежности исследуемых объектов [6-9].

В работе предпринята попытка оценить в первом приближении межпопуляционные различия на уровне присутствия или отсутствия в исследуемых STR-маркерах точковых нуклеотидных замен (SNP).

Методической основой работы является комплексный анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) и полиморфизма последовательности амплифицированных фрагментов (ППАФ) ДНК с помощью масс-спектрометрической аналитической платформы PLEX-ID («Abbott Molecular», США) [10-12]. Принцип действия, особенности и опыт использования этой передовой технологии описаны ранее [2-4, 11].

Использовали следующий материал:

- биологические образцы от 87 этнических чеченцев;

- опубликованные данные^​1​᠎ по 310 биологическим образцам от неродственных русскоязычных индивидуумов [5];

- опубликованные данные исследований 6 различных популяционных выборок, представленные в литературных источниках [1, 12-14].

Изучали индивидуальные образцы биологического материала (образцы периферической крови и буккального эпителия), полученные в рамках выполнения молекулярно-генетических идентификационных экспертных исследований. Для настоящего проекта их использовали в деперсонализированной (обезличенной) учетной форме. Препараты ДНК выделяли с помощью набора реагентов PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit («Applied Biosystems», США), согласно инструкции производителя.

Для всех полученных препаратов в качестве предварительного контрольного исследования выполнили традиционное ПДАФ-типирование полиморфных STR-локусов хромосомной ДНК [15]. Этот «одномерный» анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов аутосомных STR-локусов геномной ДНК проводили с использованием аналитической панели AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США), в состав которой входят следующие 15 генетических маркеров: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D5S818, FGA, D19S433, vWA, TPOX, D18S51.

Продукты полимеразной цепной цепной реакции (ПЦР) фракционировали электрофоретически с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3130 («Applied Biosystems», США).

Затем для всех препаратов выполили анализ в «двумерном» формате ПДАФ/ППАФ с помощью аналитической панели PLEX-ID STR CODIS loci 120 Tests («Abbott Molecular», США), в состав которой входят следующие 13 генетических маркеров: D5S818, vWA, D3S1358, D13S317, D21S11, D8S1179, D7S820, D16S539, D18S51, FGA, CSF1PO, THO1, TPOX.

Продукты ПЦР фракционировали масс-спектрометрически с использованием автоматизированного комплекса PLEX-ID Instrument («Abbott Molecular», США) [11].

На I этапе проанализировали в сравнительном аспекте 7 массивов экспериментальных данных, а именно частоты встречаемости аллелей, установленных в формате ПДАФ/ППАФ с помощью применения масс-спектрометрического анализа, для 13 исследованных STR-маркеров: D5S818, vWA, D3S1358, D13S317, D21S11, D8S1179, D7S820, D16S539, D18S51, FGA, CSF1PO, THO1, TPOX в следующих популяционных выборках:

1) в 310 генотипах русскоязычных индивидуумов [5];

2) в 193 генотипах афроамериканского населения США [1, 12, 13];

3) в 213 генотипах испаноязычного населения США [1, 12, 13];

4) в 181 генотипе белого населения США [1, 12, 13];

5) в 98 генотипах этнических австрийцев [12, 14];

6) в 93 генотипах якутов [12, 14];

7) в 108 генотипах народности Khoisan (Южная Африка) [12, 14].

Данные о долевом участии SNP-содержащих аллельных форм в общем аллельном пуле для каждой из исследованных популяций представлены в табл. 1 и в графической форме на рис. 1 для четырех наиболее репрезентативных выборок.

Проведенный сравнительный анализ этих данных показал следующее. В той или иной мере феномен полиморфизма нуклеотидной последовательности аллелей STR-локусов хромосомной ДНК свойствен всем исследованным популяционным выборкам. Учитывая этническую и географическую отдаленность исследованных популяционных выборок, можно предположить, что этот феномен (наличие SNP в STR-аллелях) является достаточно распространенным явлением, по всей видимости, свойственным большинству современных этнических групп.

Для шести исследованных STR-маркеров: D13S317, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, которые обладают полиморфизмом последовательности в русскоязычной выборке [5], в других исследованных популяциях наблюдается сравнимый уровень SNP-содержащих аллельных вариантов (этот уровень определен как процентное содержание вариантных аллелей в общем пуле обнаруженных аллельных форм) (см. табл. 1).

Для двух локусов: TH01 и TPOX - полиморфизм нуклеотидной последовательности аллелей STR-локусов хромосомной ДНК в исследованных выборках не выявляется. Этот факт свидетельствует о том, что по крайней мере некоторые из полиморфных STR-маркеров могут представлять достаточно консервативные участки генома, характеризующиеся низкой скоростью мутационного процесса. Генотипирование таких локусов в формате анализа ППАФ не дает дополнительной индивидуализирующей информации. (Тем не менее нельзя исключить, что в перспективе в подобных консервативных локусах могут быть обнаружены редкие полиморфные аллели, возникшие и закрепившиеся в изолированных популяциях или в каких-то конкретных этнических группах.)

Для некоторых исследованных популяций в ряде локусов (D16S539, vWA, D18S51, FGA, CSF1PO) наблюдаются значительные отклонения уровня полиморфизма последовательности по сравнению с другими исследованными популяционными выборками. Эти показатели выделены жирным шрифтом в табл. 1. Особый интерес представляют две популяции: белое население США и афроамериканское население США. В них для двух маркеров (D16S539 и CSF1PO) наблюдается резко отличный уровень полиморфизма последовательности по сравнению с другими исследованными популяционными выборками (в табл. 1 эти величины выделены жирным курсивом). Действительно, в исследованной выборке белого населения США, в отличие от других популяций, в локусе D16S539 отсутствуют SNP-содержащие аллели. Обратная ситуация наблюдается для локуса CSF1PO: в выборке афроамериканского населения США SNP-формы аллелей этого консервативного маркера составляют заметную долю, в то время как в других популяциях они отсутствуют. Это естественным образом наводит на мысль, что наличие или отсутствие SNP-вариантов STR-аллелей может являться особенностью (отличительный признак) той или иной определенной этнической группы.

Это предположение весьма важное с практической точки зрения и требует, возможно, большей конкретики. Здесь оно сформулировано в самой общей форме. Дело в том, что изученные нами популяционные данные из литературных источников [1, 12-14] отражают и позволяют оценить лишь общий уровень полиморфизма нуклеотидной последовательности STR-маркеров в соответствующих выборках: в этих работах для каждого исследованного локуса определено только долевое содержание SNP-вариантных аллелей в общем аллельном пуле. Эта информация недостаточна для того, чтобы сформировать детальную картину представленности конкретных SNP-вариантов STR-аллелей в различных выборках и выявить такие особенности аллельного спектра, которые могли бы быть свойственны той или иной конкретной популяционной группе.

Чтобы восполнить этот пробел, на II этапе работы провели иллюстративное исследование ограниченной моноэтнической выборки на примере 87 образцов биологического материала этнических чеченцев.

В полученных препаратах хромосомной ДНК для панели из 13 тестируемых аутосомных STR-локусов SNP-содержащие варианты электрофоретически идентичных аллелей выявилив 5 из 13 STR-маркеров (табл. 2): D13S317, D8S1179, vWA, D7S820, D16S539.

Диаграмма, отражающая количественный прирост числа аллелей за счет выявления новых ПДАФ/ППАФ-аллельных вариантов, представлена на рис. 2.

Таким образом, в данной выборке этнических чеченцев наблюдается относительно низкий уровень полиморфизма последовательности STR-аллелей. Этот факт нельзя считать показательным: такой общий низкий уровень аллельного разнообразия вполне можно объяснять ограниченным размером исследованной выборки.

Для каждого из пяти указанных маркеров, в которых обнаружили аллельные SNP-варианты, определяли популяционные частоты аллелей в формате ПДАФ/ППАФ и рассчитали прирост основных параметров информативности - дискриминирующего потенциала Pd [16, 17] и потенциала исключения Pe [18, 19]. Отметим, что максимальное увеличение Pd и Pe (наблюдается для локуса D13S317) составило примерно 4,1 и 17,6% соответственно (рис. 3 и 4).

На основании полученных данных провели сравнительный анализ аллельных спектров в двух выборках - русскоязычных россиян и чеченцев (табл. 3, рис. 5).

Этот анализ позволил выявить аллельные формы, присутствующие исключительно в русской или исключительно в чеченской выборках.

Первый феномен на данном этапе не может быть прокомментирован однозначно: при условии объективно малого размера чеченской выборки естественно предположить, что аллельные варианты, встретившиеся только у русских, просто случайно не попали в исследованную выборку чеченцев.

Совсем по-другому выглядят аллели, которые присутствуют исключительно в чеченской выборке. (Такие аллели обнаружены для 5 STR-локусов: D5S818, vWA, D13S317, D16S539, D21S11) (см. табл. 3). Для них очевидна объективная и существенная разница в представленности в различных выборках. Такие признаки представляют обоснованный интерес, поскольку их можно рассматривать как потенциальные молекулярно-генетические маркеры конкретной популяционной группы.

Надо понимать, что полученные результаты в этой части имеют лишь предварительный, иллюстративный характер. Более точные выводы о возможности использования тех или иных особенностей полиморфизма нуклеотидной последовательности STR-локусов хромосомной ДНК в качестве инструмента для определения этногеографической принадлежности индивидуума могут быть сделаны только на основе анализа более репрезентативных популяционных выборок.

Работа в этом направлении ведется нами в настоящее время.

Конфликт интересов отсутствует .