Введение
Современная концепция репродуктивного старения женщины основана на теории истощения фолликулярного запаса яичников и снижения уровня основного женского полового гормона эстрадиола [1]. Эстрогенный дефицит способствует развитию болезней старения: атеросклероза, артериальной гипертензии, дислипидемии, инсулинорезистентности, сердечно-сосудистых, неврологических и костно-мышечных заболеваний.
Не существует единых маркеров старения. Однако во многих работах для оценки биологического возраста используются скорость пульсовой волны (СПВ) как отражение состояния магистральных артерий [2], а также длина теломер как показатель клеточного старения [3, 4].
Ассоциация повышения жесткости магистральных артерий с увеличением сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности продемонстрирована в ряде исследований [2, 5]. СПВ более 10 м/с включена в рекомендации по артериальной гипертонии как маркер поражения органов-мишеней [6].
Теломеры являются некодирующими повторяющимися нуклеотидными последовательностями, расположенными на концах хромосом. Они препятствуют повреждению ДНК и укорочению хромосом. С каждым клеточным делением длина теломер уменьшается из-за неполной репликации [7]. В ряде работ показана связь укорочения длины теломер с развитием сердечно-сосудистых заболеваний, болезнью Альцгеймера и повышенной смертностью лиц старше 60 лет [8, 9]. Ускоренная эрозия теломер связана не только с возраст-ассоциированными заболеваниями, но и может более точно предсказать процесс биологического старения, чем хронологический возраст [10]. Скорость укорочения теломер связана с полом, однако на протяжении жизни эта зависимость может меняться. При рождении длина теломер одинакова у мужчин и женщин, но при достижении взрослого возраста теломеры у женщин в среднем длиннее, чем у мужчин [11]. Считается, что на длину теломер защитное влияние могут оказывать эндогенные эстрогены [12].
Менопаузальная гормональная терапия (МГТ) широко применяется для лечения климактерического синдрома у женщин в постменопаузе, а также у женщин с кастрационным синдромом и преждевременной недостаточностью яичников (ПНЯ). В настоящее время обсуждается вопрос, могут ли эстрогены в составе МГТ системно замедлять старение женщин. Выдвигается гипотеза о том, что позитивное влияние экзогенных эстрогенов на организм женщины опосредуется через сохранение длины теломер [12].
Цель исследования — оценить влияние длительной менопаузальной гормональной терапии на показатели биологического возраста женщин.
Материал и методы
Данное одномоментное клиническое исследование проведено в соответствии с правилами качественной клинической практики международной конференции по гармонизации (ICH GCP), этическими принципами, изложенными в Директиве Европейского Союза 2001/20/ЕС, и требованиями российского законодательства. Клиническое исследование одобрено локальным этическим комитетом МНОЦ ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова» (Протокол 5/21 от 17.05.21).
В исследование включены 25 женщин, получавших МГТ: у 14 из них имела место своевременная менопауза (СМ+МГТ+) и у 11 — ПНЯ (ПНЯ+МГТ+). Критериями включения в исследование для пациенток группы СМ+МГТ+ были: возраст ≥50 лет, менопауза ≥5 лет, прием МГТ ≥5 лет. Критериями включения в исследование для пациенток группы ПНЯ+МГТ+ были: возраст <40 лет, соответствие критериям ПНЯ [13], прием МГТ ≥5 лет.
Группа контроля сформирована из базы данных Медицинского научно-образовательного центра ФГБОУ ВО «МГУ им. М.В. Ломоносова» и включила женщин, не получавших МГТ, и мужчин:
— 14 женщин со своевременной менопаузой длительностью более 5 лет, в возрасте ≥50 лет (СМ+МГТ–);
— 11 женщин с сохраненной менструальной функцией в возрасте <40 лет (ПНЯ–, МГТ–);
— 28 мужчин в возрасте ≥50 лет (М1);
— 11 мужчин в возрасте <40 лет (М2).
Для формирования групп женщин в постменопаузе сделано уравновешивание по двум признакам — возрасту пациенток и возрасту наступления менопаузы с формированием 2 групп пациенток в соотношении 1:1. Для формирования групп женщин молодого возраста сделано уравновешивание по возрасту с формированием 2 групп пациенток в соотношении 1:1. Мужчины стратифицированы в зависимости от возраста. Мужчины старше 50 лет уравновешены по возрасту с пациентками в постменопаузе в соотношении 1:1:2 (2 мужчины, 1 женщина, принимающая МГТ, и 1 женщина, не принимающая МГТ). Мужчины младше 40 лет уравновешены по возрасту с пациентками соответствующего возраста в соотношении 1:1:1 (1 мужчина, 1 женщина с ПНЯ, 1 женщина без ПНЯ).
Критериями исключения были: отказ от участия в исследовании, онкологическое заболевание в активной фазе или ремиссия менее 5 лет, наличие сердечно-сосудистых заболеваний (кроме артериальной гипертензии), морбидное ожирение.
Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.
У всех пациентов исследован биохимический анализ крови на автоматическом биохимическом анализаторе AU480 («Beckman Coulter, Inc.», Германия) с использованием коммерческих наборов данного производителя.
СПВ определяли с использованием метода аппланационной тонометрии прибор SphygmoCor CvMS («AtCor Medical Pty. Ltd.», Австралия). СПВ считалась повышенной при значении >10 м/с.
Длину теломер оценивали в мононуклеарных клетках периферической крови. Забор цельной периферической крови проводили в вакуумные пластиковые пробирки типа Vacuette с добавленной в качестве антикоагулянта солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА). Выделение мононуклеарных клеток выполнено с использованием фиколла Ficoll-Paque PREMIUM плотностью 1,077 г/мл («Cytiva, Inc.», США) согласно рекомендациям производителя. ДНК из мононуклеарных клеток выделялась при помощи набора ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА (ООО «ДНК-Технология», Россия) согласно рекомендациям производителя. Длина теломер определялась при помощи набора Relative Human Telomere Length Quantification qPCR Assay Kit («ScienCell Research Laboratories», США) согласно рекомендациям производителя, с использованием амплификатора CFX96 («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США).
Для статистического анализа применен пакет статистических программ Statistica 10 («StatSoft Inc.», США). С целью проведения оценки качественных данных использовались доли (%). Категориальные данные, а также значимые различия между ними оценены с использованием точного теста Фишера. Для поиска порогового значения длины теломер в зависимости от приема МГТ использован ROC-анализ (Receiver Operating Characteristics) с расчетом площади под кривой (Area Under the Curve — AUC) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ). Рассчитывались чувствительность (Se) и специфичность (Sp) созданных моделей. Метод логистической регрессии использован при расчете отношения шансов (ОШ) для учета множественных конфаундеров. Вид распределения данных устанавливали для анализа количественных данных в группах сравнения (тест Колмогорова—Смирнова, графический анализ данных). Данные с нормальным распределением представлены как средние и стандартное отклонение, для их сравнения использовались методы параметрической статистики (t-тест, ANOVA). Данные с ненормальным распределением представлены как медиана с интерквартильным размахом Me (Q25—Q75), для их сравнения использованы методы непараметрической статистики (тест Манна—Уитни, тест Краскела—Уоллиса). Непараметрический корреляционный критерий Спирмена применяли с целью выявления корреляционной зависимости между переменными. Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне p<0,05.
Результаты
На 1-м этапе работы проведено сравнение групп пациенток постменопаузального возраста и группы мужчин соответствующего возраста (табл. 1). В зависимости от пола и приема МГТ пациенты различались по росту и массе тела (статистически значимо выше у мужчин); по уровню ЛПВП (статистически значимо выше у пациенток, принимающих МГТ); по уровню глюкозы (статистически значимо ниже у пациенток, принимающих МГТ).
Таблица 1. Характеристика обследованных пациенток в постменопаузе и мужчин соответствующего возраста
| Параметр | Женщины (СМ+МГТ–) (n=14) | Женщины (СМ+МГТ+) (n=14) | Мужчины (М1) (n=28) | p |
| Возраст, годы* | 56,8±6,6 | 54,7±8,4 | 55,6±8,0 | 0,777 |
| Длительность менопаузы у женщин, лет**** | 10,5±6,6 | 9,6±6,4 | — | 0,729 |
| Рост, см* | 162,6±3,3 | 162,6±5,3 | 178,2±5,8 | <0,0001 |
| Масса тела, кг* | 72,3±16,3 | 65,5±9,8 | 91,9±11,5 | <0,0001 |
| ИМТ, кг/м2* | 27,4±6,5 | 24,8±3,8 | 28,9±3,7 | 0,067 |
| СД, n (%)*** | 4 (28,6) | 0 | 8 (28,6) | 0,156 |
| Курение, n (%)*** | 4 (28,6%) | 0 | 5 (17,9%) | 0,188 |
| ЧСС, уд/мин* | 72,5±8,1 | 72,8±1,9 | 70,3±9,0 | 0,581 |
| САД, мм рт. ст.* | 123,3±15,0 | 118,0±14,9 | 131,1±15,9 | 0,057 |
| ДАД, мм рт. ст.* | 77,9±11,5 | 76,0±5,2 | 79,9±9,9 | 0,519 |
| СПВ, м/с* | 11,2±2,6 | 9,7±1,9 | 11,1±1,6 | 0,136 |
| ХС общий, ммоль/л* | 6,2±1,2 | 12,3±25,5 | 5,4±1,0 | 0,239 |
| ЛПНП, ммоль/л* | 4,4±0,9 | 10,4±26,0 | 3,6±1,0 | 0,261 |
| ЛПВП, ммоль/л* | 1,15±0,26 | 1,81±0,45 | 1,06±0,27 | <0,0001 |
| ТГ, ммоль/л* | 1,41±0,87 | 1,10±0,71 | 1,61±1,09 | 0,273 |
| рСКФ, мл/мин/1,73м2* | 74,3±12,1 | 80,9±29,3 | 68,1±10,4 | 0,092 |
| Глюкоза, ммоль/л* | 5,89±1,17 | 4,42±0,69 | 6,21±1,24 | <0,0001 |
| Риск по SCORE, баллы** | 1 (1—2) | 1 (0,5—4,5) | 3 (1—4) | 0,280 |
| Длина теломер* | 9,75±0,39 | 7,55±2,89 | 9,69±0,54 | 0,0001 p1—3 — 0,731*** p2—3 — 0,006*** p1—2 — 0,008*** |
Примечание. * — данные представлены как средние и стандартное отклонение — M±SD, ANOVA; ** — данные представлены как медиана с интерквартильным размахом, тест Краскела—Уоллиса; *** — данные представлены как абсолютные значения (%), точный тест Фишера; **** — t-тест для попарных сравнений. ИМТ — индекс массы тела; СД — сахарный диабет; ЧСС — частота сердечных сокращений; САД — систолическое артериальное давление; ДАД — диастолическое артериальное давление; СПВ — скорость пульсовой волны; ХС — холестерин; ЛПНП — липопротеины низкой плотности; ЛПВП — липопротеины высокой плотности; ТГ — триглицериды; рСКФ — расчетная скорость клубочковой фильтрации.
При множественном сравнении выявлены статистически значимые различия по длине теломер. Средняя длина теломер у пациенток, принимающих МГТ, была меньше, чем у женщин, не принимающих МГТ, и у мужчин соответствующего возраста. Статистически значимых различий по длине теломер у мужчин и женщин, не принимавших МГТ, не было.
Корреляционный анализ длины теломер с возрастом пациенток и длительностью менопаузы выявил отрицательные корреляционные связи средней силы: R= –0,365 (p=0,022) и R= –0,319 (p=0,047) соответственно. СПВ, как критерий жесткости артерий, не различался между группами. Не выявлена корреляционная связь между длиной теломер и СПВ (R= –0,047, p=0,799).
Далее проведено сравнение в группах пациенток молодого возраста (группы ПНЯ+МГТ+ и ПНЯ-МГТ–) и группе мужчин соответствующего возраста (табл. 2). В зависимости от пола пациенты различались по росту и массе тела (статистически значимо выше у мужчин); уровню триглицеридов (ТГ) и глюкозы (статистически значимо выше у мужчин); по уровню липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (статистически значимо ниже у мужчин). Средняя длина теломер у мужчин молодого возраста сопоставима с длиной теломер у здоровых женщин и женщин с ПНЯ, получающих МГТ. Показатели СПВ также не различались между группами.
Таблица 2. Характеристика пациенток с преждевременной недостаточностью яичников и без преждевременной недостаточности яичников и мужчин соответствующего возраста
| Параметр | Женщины (ПНЯ+МГТ+) (n=11) | Женщины (ПНЯ—МГТ–) (n=11) | Мужчины (М2) (n=11) | p |
| Возраст, годы* | 36,7±4,3 | 34,2±2,7 | 37,1±1,4 | 0,067 |
| Рост, см* | 167,8±5,7 | 165,1±6,6 | 177,4±6,6 | 0,0004 |
| Масса тела, кг* | 67,3±11,7 | 68,8±16,9 | 91,2±18,8 | 0,005 |
| ИМТ, кг/м2* | 23,9±4,2 | 25,2±6,0 | 29,0±5,9 | 0,138 |
| Курение*** | 1 (9,1%) | 1 (9,1%) | 3 (27,3%) | 0,514 |
| ЧСС, уд/мин* | 74,5±1,5 | 71,9±11,4 | 71,9±11,7 | 0,835 |
| САД, мм рт.ст.* | 111,4±14,0 | 108,3±10,4 | 123,2±10,9 | 0,014 |
| ДАД, мм рт.ст.* | 74,3±5,3 | 70,4±9,6 | 74,5±6,8 | 0,415 |
| СПВ, м/с* | 7,4±0,5 | 7,8±1,5 | 10,9±3,9 | 0,012 |
| ЛПВП, ммоль/л* | 1,74±0,43 | 1,37±0,21 | 1,00±0,25 | <0,0001 p1—2 — 0,021 |
| ТГ, ммоль/л* | 1,23±1,34 | 0,69±0,32 | 1,90±1,18 | 0,037 |
| рСКФ, мл/мин/1,73м2* | 68,6±41,1 | 81,1±8,7 | 66,2±11,2 | 0,303 |
| Глюкоза, ммоль/л* | 4,81±0,46 | 5,12±0,67 | 6,82±2,12 | 0,002 |
| Длина теломер* | 10,56±3,84 | 10,00±0,51 | 9,65±0,61 | 0,653 |
Примечание. * — данные представлены как средние и стандартное отклонение— M±SD, ANOVA; ** — данные представлены как медиана с интерквартильным размахом, тест Краскела—Уоллиса; *** — данные представлены как абсолютные значения (%), точный тест Фишера; **** — t-тест для попарных сравнений. ИМТ — индекс массы тела; ЧСС — частота сердечных сокращений; САД — систолическое артериальное давление; ДАД — диастолическое артериальное давление; СПВ — скорость пульсовой волны; ХС — холестерин; ЛПВП — липопротеины высокой плотности; ЛПВП — липопротеины высокой плотности; ТГ — триглицериды; рСКФ — расчетная скорость клубочковой фильтрации.
Для длины теломер найдено пороговое значение в зависимости от приема МГТ с помощью ROC-анализа. Наибольшая AUC была для значения 9,51. Se модели составила 71%, Sp — 64%, AUC — 0,663 (95% ДИ=0,483—0,842). Затем проведен многофакторный анализ для оценки нескольких конфаундеров (факт приема МГТ, возраст пациенток, длительность постменопаузального периода), влияющих на длину теломер, где длина теломер оценивалась как бинарный показатель с пороговым значением 9,51 (табл. 3).
Таблица 3. Связь возраста, длительности менопаузы и приема менопаузальной гормональной терапии с длиной теломер. Модель логистической регрессии
| Показатель | Прием МГТ | Возраст | Длительность менопаузы |
| p-value | 0,009 | 0,109 | 0,409 |
| ОШ | 15,6 | 1,17 | 0,91 |
| –95%ДИ | 1,78 | 0,96 | 0,73 |
| +95%ДИ | 136,69 | 1,44 | 1,15 |
| p для модели =0,014 | |||
В нашей модели факт приема МГТ связан с меньшей длиной теломер у женщин со своевременной менопаузой независимо от возраста и длительности менопаузы.
Обсуждение
В нашем исследовании выявлены более низкий средний уровень глюкозы и более высокий средний уровень ЛПВП у женщин, принимающих МГТ, что свидетельствует о благоприятном влиянии МГТ на метаболический профиль пациенток со своевременной менопаузой. Данные о защитном влиянии МГТ подтверждены в ряде исследований [14]. Установлено, что эстрогены оказывают благотворное влияние на липидный профиль, поскольку они снижают уровень общего холестерина (ХС) и ХС липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), увеличивая концентрацию ХС липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Влияние на уровень триглицеридов (ТГ) зависит от пути введения: пероральные эстрогены увеличивают, в то время как трансдермальный 17β-E2 снижат или влияет нейтрально на концентрацию ТГ [14].
В ряде исследований показана связь длины теломер с показателями жесткости магистральных артерий [15]. Однако подобной ассоциации у женщин в нашей выборке не было. Показатели СПВ существенно не различалась у получавших и не получавших МГТ. В работе A. Benetos и соавт. показано, что только у мужчин, но не у женщин, длина теломер вносит значительный вклад в изменение пульсового давления и скорости пульсовой волны [16]. Мужчины старшего возраста контрольной группы имели сопоставимую СПВ с показателями у женщин со своевременной менопаузой, независимо от приема МГТ, что соответствует данным, полученным другими исследователями [17].
В нашей работе не получены данные о защитном влиянии МГТ на длину теломер. У женщин со своевременной менопаузой, принимающих МГТ, средняя длина теломер была меньше, чем у женщин, не принимавших МГТ, независимо от паспортного возраста. Одним из объяснений этих результатов может быть потенциальное влияние эстрогена на репликативное укорочение теломер. Клеточное деление является основным регулятором истощения теломер из-за проблемы репликации концевых участков. Влияние эстрогенной стимуляции на гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) изучено в нескольких работах [18, 19]. ГСК являются предшественниками нескольких подтипов клеток крови, включая лейкоциты и эритроциты [20], а их деление может регулироваться эстрогеном [21]. Поскольку теломеры ГСК укорачиваются с каждым раундом репликации, дифференцированные клетки крови впоследствии могут также иметь укороченные теломеры. Этот потенциальный механизм подтверждается тем фактом, что длины теломер лейкоцитов и ГКС значимо коррелируют [22].
Исследований, изучающих длину теломер у женщин на фоне МГТ, крайне мало, количество включенных в них пациенток ограничено, а результаты противоречивы. В исследовании J. Lin и соавт. показана положительная связь между воздействием эндогенного эстрогена и длиной теломер [23], при этом экзогенный эстроген в составе МГТ не влиял на длину теломер и активность теломеразы. Еще в одном исследовании, включившем более 2 000 женщин, не наблюдались значимые ассоциации между длиной теломер и продолжительностью приема гормонов в постменопаузе. В то же время более высокие концентрации эстрадиола (p=0,02) и эстрона (p=0,02) в крови связаны с более короткими теломерами лейкоцитов [24]. Надежность этого результата может быть подвергнута сомнению, так как при анализе не учитывались потенциальные экзогенные источники эстрогенов.
Исследование, включившее 1048 женщин, продемонстрировало, что длительность применения экзогенных гормонов не связана с относительной длиной теломер. Репродуктивный анамнез, отражающий большее воздействие эндогенного эстрогена, связан с более короткими теломерами [25].
Наши данные не согласуются с результатами, полученными в наиболее близком по дизайну исследовании, включившем 130 женщин, половина из которых получала МГТ более 5 лет [12]. В нем показано, что длина теломер у женщин в постменопаузе, принимавших МГТ, была больше, чем у женщин в постменопаузе без МГТ в анамнезе. Авторы сделали заключение о том, что длительная гормональная терапия у женщин в постменопаузе может замедлить сокращение теломер. Однако в исследовании не обнаружен механизм, позволяющий объяснить это явление. Известны факторы, которые регулируют длину теломер независимо от процессов репликации, например, высокий уровень окислительного стресса [26—28]. В исследовании D.-C. Lee и соавт. не удалось найти каких-либо существенных различий в уровне маркеров антиоксидантного статуса между группой МГТ и группой без МГТ, хотя при описании гипотезы исследования упор делался именно на антиоксидантную активность как на основной механизм положительного влияния эстрогена на длину теломер [12].
Противоречивость данных о влиянии МГТ на длину теломер в значительной степени связана с отсутствием проспективных рандомизированных испытаний. При одномоментном исследовании невозможно исключить, что полученные данные о длине теломер у пациенток, получающих МГТ, не связаны с непосредственным влиянием гормональной терапии. Возможно, что эти женщины исходно имели более высокую соматическую и гинекологическую морбидность и, как следствие, клинические проявления климактерического синдрома. Таким образом, есть вероятность, что МГТ назначена женщинам с исходно меньшей длиной теломер. Кроме того, известно, что большая длина теломер может быть ассоциирована с повышенным риском рака молочной железы [29, 30]. Онконастороженность врачей, осуществлявших мониторинг женщин, длительно получающих МГТ, могла быть субъективным фактором, приводившим к отмене МГТ и, как следствие, невключению таких пациенток в исследование.
В нашем исследовании выявлено, что у женщин длина теломер отрицательно связана с паспортным возрастом (чем старше женщина, тем длина теломер меньше) и длительностью менопаузы (чем дольше менопауза, тем меньше длина теломер), что также описано в ранее опубликованных работах [31, 32].
Средняя длина теломер у мужчин молодого возраста также не отличалась от таковой у женщин соответствующего возраста, то есть в нашей выборке пол не оказывал существенного влияния на длину теломер. Эти данные согласуются с некоторыми опубликованными работами [33]. В исследованиях, в которых не использовался метод Саузерн-блоттинга, длина теломер у мужчин и женщин не различалась. Однако в исследованиях, использующих этот метод, обнаружено, что длина теломер у женщин больше, чем у мужчин.
Ограничения исследования связаны с его одномоментным дизайном и небольшим размером выборки.
Заключение
В нашем исследовании продемонстрирована прямая отрицательная связь длины теломер с возрастом пациенток. Менопаузальная гормональная терапия у женщин не вызывала защитный эффект в отношении длины теломер и жесткости магистральных артерий, однако ассоциировалась с более благоприятным метаболическим профилем у женщин со своевременной менопаузой. Для определения связи менопаузальной гормональной терапии с маркерами репликативного старения необходимо проведение продольных рандомизированных исследований.
Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Я.А. Орлова, Е.Н. Андреева; сбор и обработка материала — А.Г. Плисюк, К.И. Кириллова, Р.К. Михеев; статистический анализ данных — Г.О. Долгушин; написание текста — Я.А. Орлова, Г.О. Долгушин, Е.Н. Андреева; редактирование — Е.Н. Андреева.
Финансирование. В рамках госзадания Медицинского научно-образовательного центра ФГБОУ ВО «МГУ имени М.В. Ломоносова» выполнены лабораторные и инструментальные исследования.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.