Снижение фертильности мужчин обусловлено недостаточным количеством сперматозоидов и/или их плохим качеством. Последние годы в качестве лабораторного критерия качества сперматозоидов стали применять оценку структурных нарушений хромосом: адекватную упаковку и наличие разрывов (фрагментации) ДНК [1—4].

В норме хроматин зрелых сперматозоидов плотно упакован, чтобы защитить ДНК от потенциальных повреждающих воздействий во время транзита по мужскому и женскому репродуктивному тракту. Высокая плотность упаковки хроматина достигается за счет замены белков-гистонов, характерных для всех соматических клеток организма, на специальные переходные белки и протамины. Пусковым механизмом служит модификация гистонов: специфическое метилирование, ацетилирование, фосфорилирование или убиквитинилирование [5, 6]. Этот процесс начинается в мейозе и продолжается до выхода сперматозоидов из придатка. В норме по завершении сперматогенеза и дозревания сперматозоидов протамины составляют не менее 85% белков нуклеосом [7].

Можно выделить несколько уровней структурных аномалий хроматина сперматозоидов: 1) нарушение физической целостности молекулы ДНК в виде разрыва одной или обеих полинуклеотидных цепей (фрагментация); 2) дефекты ядерных белков, препятствующие замене гистонов на протамины и последующему уплотнению ДНК; 3) нарушения пространственной третичной структуры хроматина [8—11].

Цель настоящего обзора — показать роль аномалий хроматина сперматозоидов в нарушениях репродуктивной функции.

В последнее десятилетие многими исследованиями установлен факт снижения фертильности, эффективности методов ВРТ и повышения риска врожденных уродств при увеличении уровня фрагментации ДНК в сперматозоидах [12—17]. Вероятность оплодотворения in vivo и при внутриматочной инсеминации близка к нулю, если количество сперматозоидов с повреждением ДНК превышает 25—30% [18, 19]. Количество сперматозоидов с повреждением ДНК выше у мужчин из пар с привычным невынашиванием [14, 20, 21]. Предполагается, что до 40% выкидышей может быть предсказано с помощью оценки целостности спермальной ДНК [22]. Выполненные недавно метаанализы опубликованных работ, посвященных роли фрагментации ДНК в нарушении фертильности, установили, что риск спонтанных абортов и нарушений развития зародыша после ЭКО и ИКСИ увеличивается в 2,2—2,5 раза, если количество сперматозоидов с разрывами ДНК превышает 30% [14, 23], и что нет различий при использовании стандартного протокола ЭКО и ИКСИ [24]. Согласно последним исследованиям [25], повышение частоты спонтанных абортов после ЭКО и ИКСИ происходит при 20% сперматозоидов с фрагментацией ДНК, причем при количестве сперматозоидов с разрывами ДНК выше 30% риск выкидыша возрастает более чем в 20 раз. В то же время имеются исследования, авторы которых не обнаружили значимой взаимосвязи фрагментации ДНК и результатов оплодотворения/качества зародыша после ИКСИ [26, 27]. V. Beshay и O. Bukulmez [4], авторы последнего обзора на эту тему, названного «Sperm DNA damage: how relevant is it clinically?», придерживаются мнения большинства коллег, в соответствии с которым фрагментация ДНК спермы ассоциируется с более низкой частотой беременности при естественном зачатии и внутриматочной инсеминации, но полагают, что вряд ли она влияет на результаты ИКСИ, к сожалению, существующие методы оценки фрагментации предоставляют очень мало конкретной информации о характере и степени тяжести повреждения ДНК [4]. В целом существующие данные достаточно убедительны, чтобы включить оценку фрагментации спермальных ДНК в алгоритм обследования при бесплодном браке и привычном невынашивании, но требуют совершенствования методов и уточнения норм [14, 28, 29].

Данные о влиянии нарушений соотношения между гистонами и протаминами менее очевидны. В ряде исследований [30, 31] не обнаружено существенной корреляции между дефицитом протаминов и нарушениями оплодотворения, качеством эмбрионов и результатами ЭКО/ИКСИ. В других работах [17, 32—34] показано, что дефицит протаминов и увеличение доли гистонов ведет к преждевременной конденсации хроматина, что является причиной сбоев в оплодотворении и развитии эмбриона. Некоторые авторы [35, 36] отмечают наличие прямой корреляции между повышенным содержанием сперматозоидов с фрагментацией ДНК в зрелых сперматозоидах и содержанием сперматозоидов с аномальной упаковкой хроматина, другие [37] считают, что популяция незрелых сперматозоидов не ассоциирована с повышенной фрагментацией ДНК. Предполагают, что уменьшение доли протаминов делает хроматин более чувствительным к повреждающим воздействиям [38]. Значимой разницу в качестве зародыша между группами можно считать при величине выше 30% аномальных сперматозоидов по белковому составу хроматина [39].

Пространственная структура хроматина сперматозоидов в аспекте фертильности изучена меньше всего. Имеются косвенные данные, что нарушения конденсации хроматина и вакуолизация головок сперматозоидов, по данным электронной микроскопии (ЭМИС), наряду с деформацией головки, наличием цитоплазматических капель, дефектами акросомы и шейки ассоциированы с меньшим успехом ЭКО и ПЭ [2, 40, 41]. Недавние исследования J. Franco и соавт. [42] показали положительную взаимосвязь нарушения упаковки хроматина, содержания протаминов и присутствия большой ядерной вакуоли. Но в сходном исследовании S. Watanabe и соавт. [43] не обнаружили взаимосвязи крупных вакуолей, с одной стороны, и структурных хромосомных аберраций и фрагментации ДНК сперматозоидов, — с другой. Для описания аномальной конденсации хроматина сперматозоидов при ЭМИС некоторые отечественные исследователи [44] используют термин «незрелый хроматин», что характеризуется наличием грубогранулярного и фибриллярного компонентов нуклеоплазмы, обычно характерного для удлиненных сперматид.

Не до конца ясно, как взаимосвязаны аномалии хроматина с показателями стандартной спермограммы: концентрацией, подвижностью, морфологией сперматозоидов. Предполагают, что апоптоз, признаком которого является фрагментация ДНК, служит конечным результатом различных патологических состояний и системой деградации, контролирующей сперматогенез [45, 46]. Показана корреляция индекса фрагментации ДНК с числом лейкоцитов, жизнеспособностью, подвижностью, морфологией [13, 42, 47—50]. Однако некоторые исследователи [51, 52] констатируют, что величина фрагментации ДНК не всегда связана с параметрами спермограммы — сперматозоид, морфологически расцененный как «нормальный», может иметь поврежденную ДНК [13, 53, 54]. Более того, по мнению некоторых авторов [55], фрагментация ДНК морфологически нормальных сперматозоидов оказывает особо негативное влияние на качество эмбрионов и результаты циклов ИКСИ.

Поскольку появление разрывов в структуре ДНК при репликации — неизбежный процесс в период сперматогенеза, в норме существуют механизмы биологического «ремонта» мужского генома. Имеются данные, что яйцеклетка в определенной степени способна восстанавливать повреждения ДНК оплодотворившего ее сперматозоида [56, 57]. Однако, когда повреждение ДНК сперматозоида слишком велико, репаративных способностей яйцеклетки может оказаться недостаточно [6, 58]. Тем более это оказывается невозможным в физиологически неполноценных яйцеклетках, полученных от женщин старшей возрастной группы и/или после гиперстимуляции [59]. R. Aitken и соавт. [60, 61] предположили, что попытки неэффективной репарации спермальной ДНК яйцеклеткой могут вызывать мутагенный эффект, приводящий к врожденным аномалиям и детским ракам.

Для исследования повреждения хроматина сперматозоидов предложено несколько методов (табл. 1) [62].

По данным недавнего метаанализа, привычное невынашивание беременности более строго связано с данными TUNEL, чем COMET или акридиновым оранжевым [14].

Недавно предложен новый метод детекции повреждения ДНК сперматозоидов, основанный на применении синтетического пептида, состоящего из 21 аминокислоты (DW1), связанного флюоресцентным красителем rhodamine B и взаимодействующего с критическим регионом р53 [63]. Хотя DW1 в настоящее время требует удаления оболочки с использованием детергента, дальнейшее совершенствование метода, по мнению авторов, позволит использовать его для отбора жизнеспособных сперматозоидов с неповрежденной ДНК в программе ИКСИ.

Отсутствие консенсуса при определении клинически значимых стандартов определения фрагментации ДНК и значимых пороговых уровней создает проблемы в осуществлении рутинного применения оценки целостности ДНК спермы в повседневной практике [1, 25].

После завершения упаковки хроматина на завершающих стадиях сперматогенеза большая часть ДНК ассоциирована с протаминами, только 5—15% остается связанной с гистонами. Предполагают, что эти участки после оплодотворения первыми становятся местами транскрипции и нужны для активации всего мужского генома. Но из-за того, что в этих участках ДНК остаются не защищенными протаминами, они особенно чувствительны к действию повреждающих факторов [35, 64]. Генотоксикантами являются (табл. 2)

В перечень причин повреждения ДНК сперматозоидов в последнее время включены низкодозированный финостерид [66], некоторые соматические заболевания, в том числе гипертоническая болезнь [67]. Но главной причиной негативного воздействия активных форм кислорода (АФК) на ДНК сперматозоидов считается прямое действие активных радикалов на незащищенные протаминами участки ДНК и опосредованная эндонуклеазами индукция апоптоза после повреждения клетки [3, 68, 69]. Признаком оксидативного повреждения сперматозоидов является появление особой окисленной формы ДНК — 8-hydroxy, 2'-deoxyguanosine (8OHdG) [70].

По данным недавнего Кохрановского обзора [71], от 30 до 80% мужчин субфертильны в результате повреждающего действия оксидативного стресса (ОС) на сперматозоиды; по нашим данным, — около 40% [72].

Среди факторов, приводящих к повреждению ДНК в результате ОС, кроме перечисленных выше, считают: перекрут яичка, образ жизни (избыточная масса тела, курение, высокие физические нагрузки), нехватку естественных антиоксидантов, электромагнитное излучение, инфекционно-воспалительные процессы репродуктивного тракта, варикоцеле, сахарный диабет, репротоксиканты (хлорорганические соединения, пестициды и др.) (табл. 3).

Первым этапом является изменение образа жизни и устранение факторов риска, приводящих к нарушениям структуры хромосом: перегревания, курения, ожирения, действия репротоксикантов, в том числе выхлопных газов автомобилей и др. (см. табл. 2 и 3).

Вторым этапом является этиотропное лечение потенциально устранимых заболеваний: варикоцеле и инфекционно-воспалительных процессов дополнительных половых желез. Показано, что варикоцелэктомия может восстановить повреждения ДНК у бесплодных мужчин с клиническим варикоцеле [73—75]. Лечение хронического бактериального простатита и урогенитальных инфекций (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma), сопровождающихся повышением уровня АФК, приводит к снижению выраженности ОС, нормализации показателей спермограммы и фрагментации ДНК [76, 77]. Также необходима оптимальная терапия системных заболеваний, приводящих к повреждению ДНК: сахарного диабета, гипертонии, почечной недостаточности.

Третий этап — патогенетическое лечение в случаях, когда оно возможно. К патогенетически обоснованному лечению при повышенной фрагментации ДНК на фоне ОС относится применение антиоксидантов [3, 68—72, 78—80]. Обоснованием лечения бесплодных мужчин пероральными антиоксидантами является предположение, что семенной ОС вызывается частично дефицитом антиоксидантов спермы. Практика назначения пероральных антиоксидантов поддерживается отсутствием серьезных побочных эффектов, связанных с антиоксидантной терапией, хотя некоторые исследователи [81] тщательно оценивали риски передозировки антиоксидантами. В идеале, пероральный антиоксидант должен достигать высоких концентраций в половых путях и восполнять дефицит жизненно важных элементов, необходимых для сперматогенеза. Тем не менее уровень АФК в сперме не должен быть полностью подавлен под действием пероральных антиоксидантов, поскольку это может ухудшить нормальные функции спермы (например, капацитация спермы и гиперактивация), которым обычно требуется низкий уровень АФК [82, 83].

До настоящего времени более чем в 100 клинических и экспериментальных исследованиях изучали воздействие антиоксидантов на параметры семенной жидкости. Наиболее часто изучаемые пероральные антиоксиданты включают витамины С и Е, селен, цинк, глутатион, фолиевую кислоту, L-карнитин и N-ацетилцистеин; рандомизированные контролируемые исследования антиоксидантной терапии мужского бесплодия обычно указывают на то, что лечение антиоксидантами дает благоприятный эффект (с точки зрения улучшения параметров семенной жидкости), в то время как не отмечается значительного эффекта в группе плацебо [3, 68—72, 78—80]. Среди антиоксидантов, представленных на российском фармацевтическом рынке, можно отметить препарат Селцинк плюс (селен — 0,05 мг, цинк — 7,7 мг, витамин Е — 31,5, витамин С — 180 мг, В-каротин — 4,8 мг). Он показал свою эффективность при нарушении фертильности у мужчин c хроническим простатитом IIIA в открытом сравнительном плацебо-контролируемом исследовании [84]. Антиоксидантная терапия обычно приводит к значительному улучшению целостности ДНК сперматозоидов, более адекватной упаковки на протаминах, меньшей выраженности признаков апоптоза гамет (annexin V и др.), в некоторых случаях — к увеличению частоты наступления беременности после ВРТ [3, 68—72, 78—80]. При этом существенных изменений в параметрах рутинной спермы (концентрация, подвижность, морфология) и/или концентрации мужских половых гормонов может не быть [85].

Следует отметить, что цинк в отличие от прочих соединений-антиоксидантов в комплексе со специфическими белками непосредственно регулирует конденсацию хроматина сперматозоидов [86]; дефицит цинка, как показали экспериментальные исследования, приводит к апоптозу клеток яичка [87].

В небольшом пилотном исследовании показан положительный эффект рекомбинантного ФСГ при идиопатическом бесплодии с повышенным уровнем фрагментации ДНК; при этом отмечена отрицательная корреляция эффекта с уровнем ROS [88]. Сегодня принято считать, что стимуляция сустентоцитов (клеток Сертоли) гормоном ФСГ — условие ингибирования апоптоза диплоидных сперматогоний, признаком чего является интактная ДНК, сохранение их жизнеспособности и вхождения в мейоз [89, 90].

Четвертый этап — совершенствование методов выделения и обработки сперматозоидов in vitro для последующего ЭКО. Сравнение различных методов подготовки спермы доказывает, что наиболее эффективным методом элиминации неживых и апоптотических сперматозоидов является процедура swim-up [91, 92]. Для предотвращения ОС, связанного с процедурой центрифугирования, активацией лейкоцитов на фоне удаления семенной плазмы (обладающей антиоксидантной активностью), применяют антиоксиданты in vitro: витамин Е, каталаза и глутатион защищают сперматозоид от воздействий экзогенных AФК [93—95]. В отличие от благоприятного эффекта антиоксидантов в отношении защиты сперматозоидов от экзогенных АФК антиоксиданты, по всей видимости, имеют ограниченную ценность с точки зрения защиты сперматозоидов от выработки эндогенных АФК, продуцируемых митохондриями сперматозоидов при их спонтанном апоптозе [3].

Последние годы обсуждается возможность использования для отбора качественных сперматозоидов для ИКСИ оптических систем высокого разрешения (MSOME), позволяющих обнаруживать в цитоплазме вакуоли, которые считают признаками генетических аномалий и/или незавершенного апоптоза гамет [42]. Некоторые работы [2, 40] свидетельствуют, что при использовании для ИКСИ сперматозоидов без вакуолизации цитоплазмы эффективность ЭКО ИКСИ выше, некоторые исследования [43] это не подтверждают.

Снизить высокие показатели фрагментации ДНК возможно с помощью применения в протоколах ИКСИ тестикулярных сперматозоидов. При азооспермии было показано, что тестикулярные сперматозоиды имеют менее поврежденные хромосомы [96, 97].

Обобщая клинический и эмбриологический материал, М. Bungum и соавт. [25] предложили алгоритм ведения пары с аномалиями хромосом сперматозоидов, учитывающий анамнез бесплодия, состояние репродуктивного здоровья женщины и данные исследования на фрагментацию ДНК (см.рисунок).

Оценка структурных нарушений сперматозоидов имеет самостоятельное диагностическое и прогностическое значение для пациентов с мужским фактором бесплодия, в том числе при использовании методов ВРТ. Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов и определение соотношения гистон/протамин должны служить дополнением к рутинному анализу спермы и являться прогностическим критерием для определения возможных неудач программ ВРТ.

Снижение высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов с помощью андрологических и эмбриологических методов поможет преодолеть обусловленный им мужской фактор бесплодия и невынашивания беременности.